[发明专利]一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害检测技术领域，特别是涉及环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)分子检测方法，具体是一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）是我国云南发现的双生病毒科（Geminivirade）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的病毒。由于TYLCCNV的寄主种类多，可侵染烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等作物，且发生范围广泛，如四川、云南、广西、广东及福建等地区，因此建立该病毒快速有效的检测方法对于田间病毒病害的早期监测具有重要意义。目前检测TYLCCNV的方法主要为血清学方法和PCR技术，两种方法均具有速度快、灵敏度高及特异性好等特点。但是，血清学方法检测的缺点是易出现假阳性诊断结果，而PCR技术需依赖PCR仪及凝胶电泳设备才能完成，二者均不便于在田间开展大规模的病毒病样品检测。

LAMP是由Notomi于2000年开发的一种新型核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA 聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩增。该技术避免了常规 PCR对循环温度的特殊要求，并因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。目前该技术应用于植物病毒检测方面的研究较少，还没有利用该技术检测TYLCCNV的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服传统TYLCCNV检测方法的不足，提供一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，该方法灵敏度高、特异性强、不需要凝胶电泳设备及PCR仪，可用于TYLCCNV的田间早期诊断。

本发明采用的技术方案为：利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，进行靶序列高效扩增，建立简便、快速、成本低、灵敏度高和特异性强的TYLCCNV 的LAMP检测方法，便于在田间大规模快速检测应用。

本发明所述的一种利用LAMP快速检测中国番茄黄化曲叶病毒的方法，通过如下步骤实现：

（1）采用CTAB法提取待测植株叶片的总DNA；

（2）以DNA为模板，采用以下特异性引物组进行LAMP扩增，得到扩增产物：

FIP 5′-ACTACAACCTGAGGAAAGCGTTAGTCCAGATTTTGCAGGTTAG-3′

BIP 5′-ACTTGTAATGTGATTATGTCGTGGTCAAAAATCCCCTTTATTTCAAGA-3′

F3 5′-AACGCAAGGTCTGAGGAT-3′

B3 5′-AGCAGAGAATGGCGTTTA-3′

（3）检测

电泳检测：取5 μL扩增产物经2% 琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳30 min，感染TYLCCNV的样品为明亮的呈弥散状的核酸泳带； 

荧光染色：在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ(1:1000) 2 μL，1-5 min后观察结果，感染TYLCCNV的样品由橙色变成绿色，未感染TYLCCNV的样品及空白对照保持染料的橙色。

步骤（2）LAMP扩增的反应体系为25 μL，所述反应体系中各组分的含量为：模板DNA 1.0 μL，其他组分的终浓度：Bst RNA 聚合酶8 U、 1×Reaction Buffer、2.4 mM/L MgSO₄、0.2 mM/L dNTPs、0.8 M Betaine，特异性引物组的浓度分别为：FIP/BIP 1.6 μM/L、F3/B3 0.2 μM/L，加ddH₂O补足25 μL，混匀，于63℃水浴锅中反应60 min，之后80 ℃下灭活 10 min 结束反应。

附图说明

图1为LAMP检测TYLCCNV的电泳结果：其中1为marker；2为待测样品；3为TYLCCNV阳性对照；4为阴性对照。

图2为LAMP检测TYLCCNV的染色结果：其中1为待测样品；2为TYLCCNV阳性对照；3为阴性对照。