[发明专利]一种增强基因表达的激活型siRNA

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种靶向具有TATA-box基序的基因启动子而特异性地增强基因表达的激活型siRNA。

背景技术

植物和动物的基因组中有大量的基因表达非编码RNA（non-coding RNA， ncRNA），如小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和转运RNA（transfer RNA，tRNA）等。非编码RNA在基因的转录、转录后水平乃至动物发育和疾病发生的过程中起到了重要的调节作用。利用与目的基因同源的双链RNA分子抑制目的基因表达的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术在功能基因组研究、基因治疗、新药开发等领域具有广泛的应用，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。

外源性siRNA主要由转基因转录或病毒感染诱导产生，内源性siRNA的来源比较广泛，如基因组上的重复序列（着丝粒、转座子）、假基因衍生的反义转录物等。siRNA的前体dsRNA出核后，在细胞质中被dsRBP蛋白识别并结合，并由Dicer酶切成21～25nt、3’端具有2nt悬垂、5’端具有磷酸基团的siRNA，然后被Ago蛋白结合而形成RISC，siRNA的反义链通过序列匹配使RISC与靶RNA特异性结合，Ago蛋白将靶RNA酶切一个缺口使其进一步被降解。除了介导基因沉默，近年来的研究还发现微小RNA（microRNA）和siRNA可以激活基因的表达。例如，miR-744和miR-1186能够靶向Ccnb1的启动子诱导其表达而调节小鼠细胞的扩增；靶向E-钙粘蛋白、p21、血管生长因子等基因启动子的dsRNAs可以长期诱导序列特异性的基因表达的激活。

上调某些基因的表达在科学研究及临床治疗中具有重要的价值，例如，可以通过增强糖尿病病人的胰岛素表达量而缓解其症状；可以通过增强DNA损伤修复基因的表达来延缓衰老；可以通过增强抑癌基因的表达来预防或治疗癌症等等。而目前尝试上调基因的方法主要是通过人工设计转录因子模拟物，但是与内源转录因子相同，会引起大量的下游靶基因的表达而不能单独特异性抬高某一个基因的表达，因此无法广泛应用。

鉴于RNAi技术在实验研究和临床应用中的重要作用，人们总结了设计沉默型siRNA的一些规则，但是目前对于靶向基因启动子的激活型siRNA的研究，鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺乏对于增强基因表达的激活型siRNA的研究的缺陷，提供一种针对靶向具有TATA-box基序的基因启动子而特异性地增强基因表达的激活型siRNA。

本发明所提供的激活型siRNA是通过靶向具有TATA-box基序的基因启动子而特异性地增强基因表达，具有以下特征：

（1）与以TATA-box基序为中心的位置互补；

（2）反义链的前两个碱基使用UA；

（3）长度为23个核苷酸；

（4）反义链的3’端进行甲基化修饰；

（5）避免反义链3’端的错配。

优选地，对所述的激活型siRNA的反义链的3’端4个核苷酸进行甲基化修饰。

本发明所述的增强基因表达的激活型siRNA还具有以下特征：

（1）靶向基因启动子的双链siRNA及单链反义RNA；

（2）长度为15~29碱基且3’端带dTdT悬垂的双链siRNA；

（3）体外合成的经过化学修饰的双链siRNA及单链反义RNA；

（4）3’端与靶标的配对至关重要的双链siRNA及单链反义RNA。

本发明所述的能够激活启动子的活性的siRNA，是针对人的17个具有TATA-box基序的的基因启动子设计的，这17个具有TATA-box基序的基因启动子来源为：人IL-2、Insulin、APOE、RHO、HIV-1、c-Myc、BCL2L12、HBB、CIRBP、L-Myc、CALCA、Z-globin、GAPD、LHB、IL-6、POMC和NPPA，其基因靶点序列按上述顺序分别为SEQ ID NO:1～17，其中：

人IL-2：5’-CAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTT-3’   SEQ ID NO:1；

Insulin：5’-GGGCTCTGAGACTATAAAGCCAGCGGGGGCC-3’  SEQ ID NO:2；