[发明专利]一种真菌菌丝总DNA的提取方法在审
| 申请号： | 201410102771.1 | 申请日： | 2014-03-19 |
| 公开（公告）号： | CN103820434A | 公开（公告）日： | 2014-05-28 |
| 发明（设计）人： | 李小林;郑林用;李昕竺;曾先富;黄羽佳 | 申请（专利权）人： | 四川省农业科学院土壤肥料研究所;成都市农林科学院;四川省技术创新促进会 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12R1/645 |
| 代理公司： | 成都虹桥专利事务所(普通合伙) 51124 | 代理人： | 高芸;梁鑫 |
| 地址： | 610066 四川省成都市锦江区*** | 国省代码： | 四川;51 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 真菌 菌丝 dna 提取 方法 | ||
1.真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）收集真菌菌丝体；
（2）真菌菌丝体置于DNA提取液中，捣碎真菌菌丝体；
（3）在-70℃至-85℃的低温环境与60-65℃水浴环境中反复冻融2～3次；
（4）加入蛋白酶K和溶菌酶处理；
（5）去酶及纯化DNA。
2.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（2）所述DNA提取液各组分浓度为：80-120mmol/LTris-HCl，80-120mmol/L乙二胺四乙酸，80-120mmol/L磷酸钠，1.0-1.5mol/L氯化钠，0.8-1%(g/g)十六烷基三甲基溴化铵，pH值=7.8-8.2，溶剂为无菌蒸馏水；优选溶剂为灭菌双蒸水。
3.根据权利要求2所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（2）DNA提取液的各组分浓度为：100mmol/LTris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠，1%(g/g)十六烷基三甲基溴化铵，pH值=8.0，溶剂为无菌蒸馏水；优选溶剂为灭菌双蒸水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（2）DNA提取液的添加量为：每1g真菌菌丝体添加DNA提取液1-1.6ml，优选1.5ml。
5.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（3）所述的具体条件是：在-70℃至-85℃的低温环境放置5-10min，再在60-65℃水浴环境中放置15-20min，如此反复冻融2～3次。
6.根据权利要求5所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（3）所述的具体条件是：在-80℃的低温环境放置5-10min，再在65℃水浴环境中放置20min，如此反复冻融2～3次。
7.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为：
按1g菌丝量计算，加入8-12mg/mL蛋白酶K40-60μL，80-120mg/ml溶菌酶40-60μL，涡旋混匀后，于37℃的环境，在150-200r/min的条件下振荡15-30min。
8.根据权利要求7所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为：
按1g菌丝量计算，加入10mg/mL蛋白酶K50μL，100mg/ml溶菌酶50μL，涡旋混匀后，于37℃的环境，在200r/min的条件下振荡30min。
9.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（5）去酶及纯化DNA包括如下步骤：
A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸钠溶液180-230μL，涡旋混匀后水浴，水浴条件：58-63℃、1.5-2.0h，期间每10-30min振荡1次；
B、室温条件下，5000-6000r/min离心10-15min，取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍体积50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4℃环境下放置过夜；所述聚乙二醇的相对分子质量为4000－6000；
C、室温条件下，6000-7000r/min、3-5℃离心25-35min，弃上清液，并于沉淀中加入TE溶液500μL，氯仿-异戊醇体积比为24:1的溶液450-550μL，涡旋混匀，11000-12000r/min，3-5℃离心4-6min，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH=7.5-8.5，溶剂为无菌蒸馏水，优选为灭菌双蒸水；
D、于步骤C所得上清液中加入0.8-1.5倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.5-0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2-2.5h，11000-12000r/min，3-5℃离心4-6min，弃掉上清液；
E、于步骤D所得沉淀中加入预冷的70%(v/v)乙醇500-600μL洗涤沉淀，11000-12000r/min，3-5℃离心4-6min，弃掉上清液；
F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。
10.根据权利要求9所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于：步骤（5）去酶及纯化DNA包括如下步骤：
A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸钠溶液200μL，涡旋混匀后水浴，水浴条件：60℃、1.5h，期间每30min振荡1次；
B、室温条件下，5000r/min离心10min，取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.5倍体积50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4℃环境下放置过夜；
C、室温条件下，6000r/min、4℃离心30min，弃上清液，并于沉淀中加入TE溶液500μL，氯仿-异戊醇体积比为24:1的溶液500μL，涡旋混匀，12000r/min、4℃离心5min，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0，溶剂为无菌蒸馏水；优选为灭菌双蒸水；
D、于步骤C所得上清液中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2h，12000r/min、4℃离心5min，弃掉上清液；
E、于步骤D所得沉淀中加入预冷的70%乙醇500μL洗涤沉淀，12000r/min、4℃离心5min，弃掉上清液；
F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于四川省农业科学院土壤肥料研究所;成都市农林科学院;四川省技术创新促进会，未经四川省农业科学院土壤肥料研究所;成都市农林科学院;四川省技术创新促进会许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201410102771.1/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇：具有良好性能的煤田勘探钻头的制造方法
- 下一篇：护筒压拔钻机
