[发明专利]一种真菌菌丝总DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌的分子生物学研究领域，具体涉及一种真菌菌丝总DNA的提取方法。

背景技术

在真菌的分子生物学研究中，真菌总DNA的提取至关重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步骤大体相似，关键在于如何有效地破碎细胞壁，有的是通过机械来进行破碎细胞壁，有的是通过酶等物质来消化去壁。由于真菌细胞壁上富含多糖等物质，因此即使是液氮冷冻干燥研磨后也很难被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事实上，目前大部分实验室所采用的破壁方法均是液氮冷冻干燥研磨，但是使用液氮研磨容易冻伤皮肤，需要强力研磨，费时费力，受研钵数量的限制容易产生交叉污染，在研磨过程中真菌菌丝也容易损失，效率也不高，特别是一些单位和机构由于液氮及干冰不易获取而使其受到严重限制。因此急需一种免液氮研磨而又能较为彻底打破细胞壁的真菌提取技术。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种免液氮研磨而又能较为彻底打破细胞壁提取真菌菌丝总DNA的技术。

本发明提供的真菌菌丝总DNA的提取方法的技术方案如下：

（1）收集真菌菌丝体；

（2）真菌菌丝体置于DNA提取液中，捣碎真菌菌丝体；

（3）在-70℃至-85℃的低温环境与60-65℃水浴环境中反复冻融2～3次；

（4）加入蛋白酶K和溶菌酶处理；

（5）去酶及纯化DNA。

其中，步骤（2）所述DNA提取液的各组分浓度为：80-120mmol/L Tris-HCl，80-120mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，80-120mmol/L磷酸钠，1.0-1.5mol/L氯化钠，质量百分比为0.8-1%（g/g）十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH值=7.8-8.2，溶剂为无菌蒸馏水，溶剂优选灭菌双蒸水。采用本发明DNA提取液具有毒性低、刺激性小及生物降解性高的优点。DNA提取液的添加量为：每1g真菌菌丝体添加DNA提取液1-1.6ml，优选1.5ml。

进一步优选，步骤（2）所述DNA提取液的各组分浓度为：100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠，质量百分比为1%（g/g）十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH值=8.0，溶剂为无菌蒸馏水；溶剂优选灭菌双蒸水。

其中，步骤（3）所述的具体条件是：在-70至-85℃的低温环境放置5-10min，再在60-65℃水浴环境中放置15-20min，如此反复冻融2～3次。

进一步优选，步骤（3）所述的具体条件是：在-80℃的低温环境放置5-10min，再在65℃水浴环境中放置20min，如此反复冻融2～3次。

其中，步骤（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为：

按1g菌丝量计算，加入蛋白酶K(8-12mg/mL)40-60μL，溶菌酶(80-120mg/ml)40-60μL，涡旋混匀后，于37℃的环境，在150-200r/min的条件下振荡15-30min。

进一步优选，按1g菌丝量计算，加入蛋白酶K(10mg/mL)50μL，溶菌酶(100mg/ml)50μL，涡旋混匀后，于37℃的环境，在200r/min的条件下振荡30min。

本发明采用的蛋白酶K能使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，使DNA充分游离；溶菌酶能有效地菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键进而破碎细胞壁，释放DNA。具有操作简便，避免使用液氮研磨而带来的劳动强度和交叉污染的优点。

其中，步骤（5）去酶及纯化DNA具体包含下述步骤：

A、加入20%（g/g）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液180-230μL，涡旋混匀后水浴，水浴条件：58-63℃、1.5-2.0h，期间每10-30min振荡1次；

B、室温条件下，5000-6000r/min离心10-15min，取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍体积50%（g/g）聚乙二醇溶液，在4℃环境下放置过夜；所述聚乙二醇的相对分子质量为4000－6000；