[发明专利]检测BRAF基因突变的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别是涉及一种检测BRAF基因突变的方法及其试剂盒。

背景技术

结直肠癌发病率逐年增高，晚期及术后复发患者需要生物靶向治疗。美国FDA及我国结直肠癌术后治疗方案中明确指出，在进行一线和二线化疗方案实施中，拟加入靶向EGFR受体抗体靶向药物（西妥昔单抗和帕尼单抗）时，需进行药敏基因突变检测。国际大样本多中心研究表明，同时进行KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因突变检测，并按此顺序串联诊断，可最大限度地准确预测患者对于抗体靶向药物的敏感性（参见文献Roock WD,Claes B,Bernasconi D et al.Effects of KRAS,BRAF,NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer:a retrospective consortium analysis.Lancet Oncol,2010,11:753-62.)。

目前针对BRAF基因突变的检测方法主要有：直接测序法（Direct Sequencing)、高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis，HRM)和扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)。直接测序法（Direct Sequencing)以PCR扩增技术为核心，其灵敏度较低大于10%，有碍其临床广泛应用(参考文献Lynch T,Bell D,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non–small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med,2004,350(21):2129-2139.Paez J,Janne P,Lee J,et al.EGFR mutations in lung cancer:Correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science,2004,304(4):1497-1500.)。高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis，HRM)是利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列溶解曲线不同的原理，在PCR扩增后根据扩增产物的熔点不同完成对样品突变分析，其灵敏度可达1%，但需要高灵敏度的精密Q-PCR仪，多用于研究中，限制了其临床应用(参考文献Li LH,Tze KE,Chih CC,et al.Characteristics and prevalence of KRAS,BRAF,and PIK3CA mutations in colorectal ancer by high-resolution melting analysis in Taiwanese population.Clinica Chimica Acta,413(2012)1605–1611)。扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)是设计引物3′端序列分别野生和突变互补，针对突变的等位基因进行特异性扩增和鉴定。另外Scorpions为蝎形结构的特异性探针，包含一个与3′端共价相连的PCR引物，引物仅仅识别突变序列，而不识别正常序列，在即时PCR反应中，当探针与扩增子（即突变序列）连接进行扩增时，荧光基团与淬灭基团分离，反应试剂中荧光度增强。Scorpions与ARMS技术联和应用（SARMS）可检测单个突变，对于已知基因的检测，SARMS具有高度的敏感性0.1%。该方法的缺点是：1）每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定；2）可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性。该方法主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜检组织类，2小时即可完成检测，试剂盒商业化程度高，临床认可程度高，国内已有试剂盒获SFDA生产批文【参考文献Newton CR,Graham A,Heptinstall LE,et al.Analysis of any point mutation in DNA:the amplification refractory mutation system(ARMS).Nucleic Acids Res,1989,17(7):2503-2516.Marcin M.Machnicki,Eliza GM,Tomasz L,et al.ARMS-PCR for detection of BRAF V600E hotspot mutation in comparison with Real-Time PCR-based techniques.ACTA BIOCHIMICA POLONICA,Vol. 60,No1/2013:57–64.Fox JC,et al.The detection of K-ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system,Br J Cancer1998;77:1267-74.】。