[发明专利]一种基于SHWS的相位显微镜成像方法

说明书

技术领域

本发明属于显微镜成像技术领域，具体涉及一种基于SHWS（Shack-Hartmann Wavefront Sensor，沙克哈特曼波前探测器）的相位显微镜成像方法。

背景技术

近年来，随着科技的进步，光学显微镜以更高的空间分辨率，更大的成像深度以及对活体细胞无损探测的可行性，成为生物学家和临床研究人员研究的热点。它已经成为生物学和医学研究中必不可少的工具，是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要基础。目前在细胞生物学中，除了普通光学显微镜以外、还有荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、相位显微镜等多种显微镜。

其中，相位显微技术包括相衬显微镜，微分干涉差显微镜和定量相位显微镜等，它们通过测量样本引起的相位延迟来得到可视化的生物结构。生物细胞内，不同的折射率分布将引起光波不同的相位延迟，这些显微技术将折射率的空间差异转换成为图像的对比度。而折射率是物体固有的对比源，同时也是一个重要的生化参数，与分子的浓度成正比。大多数生物细胞在可见光下的吸收可以忽略，但是其内部不同的细胞器之间存在着折射率的差异。因此，在生物学研究中，折射率已经成为一个比吸收率更好的内生对比源。但是，在通常情况下，活体细胞的折射率差异是非常微弱的，这就需要对光信号进行调制来提高成像对比度。

通常，相衬显微镜采用一个使零频衰减同时相移90°的位相板进行空间滤波，将物体的位相结构转换成像平面上的光强分布。微分干涉差显微镜采用两个渥拉斯顿棱镜使两束光在不同时间经过样品的相邻部位，由于样品的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差，从而将样品中的微小差别转化成图像的明暗区别。这两种显微技术利用干涉技术来提高图像对比度，将细胞内折射率差异引起的透射光的相位变化转换成强度分布。但是，这些技术提供的不是定量的相位变化图。定量相位显微镜通过对参考光束进行调制，使得样本光束和参考光束之间产生相移，再对两光束进行干涉来测量样本微小的折射率差异。而近年来发展的相位显微技术已经可以定量的记录由样本引起的相位延迟。但是相位延迟正比于折射率与路径长度的乘积，更一般的讲是折射率与光学系统点扩散函数的卷积。因此，这些技术仅可以提供细胞的平均折射率参数或者细胞的厚度，而没有细胞的详细的三维结构。

最近几年，在定量相位显微技术的基础上，很多研究小组已经开发了能够测量生物细胞三维折射率分布的多种新型显微镜技术，如断层相位显微镜、STPM（synthetic aperture tomographic phase microscopy，合成孔径层析相位显微镜）、DHM（digital holographic microscopy，数字全息显微镜）、OSH（optical scanning holography，光学扫描全息显微镜）等。这些显微镜技术的共同策略是采用计算机断层扫描仪多角度采集吸收系数投影数据的方式，记录不同角度的相位投影数据，从而重建出生物细胞的三维折射率分布。这些新型的显微镜技术具有比传统光学显微镜更高的精度和空间分辨率，并且能够得到样品的三维定量结构信息。

然而，传统的三维定量相位显微镜系统是以外差马赫-泽德干涉仪为基础搭建起来的，采用时间频率调制法使参考光相对于样本光波产生一个固定的频率差，然后从随时间变化的干涉场中得到样本的定量相位图像，从而计算出各个位置的折射率，再得到细胞内部的结构信息。这样的方法，使得计算过程十分复杂，另外，振动带来的干扰，对测量结果会引入巨大的噪声，从而使得测量结果不准确。

发明内容

针对现有技术所存在的上述技术问题，本发明提供了一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，解决了硬件构造复杂，重建过程繁琐，振动引入噪声等问题。

一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，包括如下步骤：

（1）针对不放样品和放样品两种情况，利用SHWS进行探测得到两种情况下各角度光线对应的Hartmanngram（沙克哈特曼图）；

（2）根据所述的Hartmanngram计算上述两种情况下SHWS前透镜方阵中每一透镜在各角度光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布；

（3）根据所述的质心分布计算出各角度光线通过每一透镜后的波前斜率；

（4）根据所述的波前斜率利用区域迭代法估计每一透镜对各角度光线成像所引入的波前相位，进而得到对应各角度光线的波前相位方阵；