[发明专利]一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒。

背景技术

分枝杆菌（Mycobacterium）包括140多个种属，总体上被分为三大类，结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex ，MTBC)，麻风杆菌（M.leprae）以及非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacterial, NTM）。MTBC包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌，致病性强，是引起动物结核病的主要病原，但种类相对较少。与其相比NTM数量多（多达百余种）、分布广，部分为致病菌或条件致病，因NTM的形态于MTB近似，具有抗酸染色阳性的特点，且NTM与MTB在菌体成分和抗原性上多具共性，因此NTM与MTB在形态上和免疫学检测上具有较大难度。以细菌培养为基础的传统生化鉴定方法，费力耗时、结果提供不及时,有时结果不准确。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的鉴定方法，如PCR-SSCP、PCR-RFLP、DNA探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐，但对检测人员技术水平要求高、仪器昂贵、检测周期长，为满足快速鉴别分类的需求，为科学研究提供快速方便的方法，缩短结核分枝杆菌复合群鉴别时间，降低鉴别技术难度和费用，本发明以恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒，该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种结核分枝杆菌复合群的快速检测方法，包括以下步骤：

1）根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计5条SmartAmp恒温扩增引物；

2）加入待检样品DNA，在上述引物及DNA 聚合酶的作用下进行恒温扩增反应；

3）根据扩增结果判断待检样品是否为结核分枝杆菌复合群。

步骤1）所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：

TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；

FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；

BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；

OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；

OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。

步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8 μmol/L、OP1和OP2引物各0.5 μmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、（NH₄）₂SO₄ 10 mmol/L、MgCl₂ 2.5 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO₄ 2 mmol/L、STYO-9 5 μmol/L、pH为8.8的Tris-HCl 20 mmol/L、0.1% Triton X-100、6U Bst DNA酶，1μg Tap Muts、1μL DNA 模板。

步骤2）所述的恒温扩增反应的程序为：60～65℃反应20～40 min。

一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其含有根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计的5条SmartAmp恒温扩增引物。

所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：

TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；

FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；

BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；

OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；

OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。

所述试剂盒中还包括恒温扩增反应液、SYTO-9、Tris-HCl、Triton X-100、Bst DNA聚合酶， 错配结合蛋白Tap Muts。