[发明专利]猪细环病毒I型和II型的双重实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本申请涉及分子检测领域，特别是涉及一种猪细环病毒I型和II型的双重实时荧光PCR检测方法。

背景技术

TTV是一种无包被的单股环状负义的DNA病毒，由于最初是在肝炎患者中分离得到，猜测与肝炎有关，受到医学领域的广泛关注。猪源TTV的中文名字被定义为猪细环病毒（Torque Teno Sus Virus，TTSuV）。流行病学研究发现，TTV通过输血、性行为、粪-口途径等方式进行传播，同时血液、唾液、粪便、乳汁、胆汁均可带毒，通过不同人群的TTV的感染率的研究结果显示：一般人群的感染率多在10%以上，呈无症状携带。除了人可感染TTV以外，猫、狗、猪、牛、鸡、羊、老鼠等动物也是TTV的宿主。Okamota H等根据人TTV非编码区的DNA序列设计引物，扩增了猪、狗和猫血清中的TTV基因片段，发现在这几个不同种属中TTV基因序列和长度差异极大，核酸同源性较小，具有物种专一性。美国学者Leary等应用巢式PCR方法从猪血清中检测到TTV（Sd-TTV31），基因组长度为2878bp。2005年，Niel C等利用多重引导滚环式扩增法(Multiply primed rolling-circle amplification,RCA)检测到猪TTV的另一种亚型：Sd-TTV2p，基因组长度为2735bp，与之前发现的Sd-TTV31的同源性非常低，只有45.1%，于是将TTSuV分为两种基因型，TTSuV1型以Sd-TTV31为原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p为原型。目前，统一的将TTSuV1型称为猪细环病毒I型（简写TTSuV I），TTSuV2型称为猪细环病毒II型（简写TTSuV II）。

TTSuV和人TTV基因组结构组成相似，由非编区(UTR)和编码区两部分组成，非编区由一个富含GC的区域、一个启动子和一个转录增强子组成，两末端的GC区域形成具茎环的二级结构，在病毒复制中可能有重要调控作用；TTV编码区包含3个开放阅读框(ORF1～ORF3)、一个PolyA和一个TATA盒，变异率较高。ORF1的N端富含精氨酸(Arg)蛋白质，该蛋白质有可能是复制相关的蛋白-Rep蛋白；ORF2编码与复制相关的蛋白；ORF3编码结合蛋白，分为两段，其中隔着一个类似于真核生物编码区中内含子的序列。编码区转录时产生3种不同的mRNA，能翻译表达6种不同的蛋白。两种基因型TTV编码蛋白具有相似的序列和功能。

国外已有许多相关报道，表明TTSuV的感染在全球分布很广且其流行率很高。Segalés等对西班牙猪场1985-2005年采集的162份猪血清进行追溯性调查，结果在所有年份均检出TTSuV病毒，TTSuV1和TTSuV2的感染率分别是33.3%（54/162）和55.6%(90/162)，两种基因型共感染率为23.5%（38/162），证实了TTSuV的感染早在最初发现这病毒(Leary et al.,1999)的14年前就存在了。

近年来，国内也陆续开展了对TTSuV感染情况的研究。这些研究显示，TTSuV在猪群中的感染在国内外已经非常普遍，是一个不容忽视的新病原。而目前对TTSuV的了解还非常有限，综合国内外检测TTSuV的方法主要有血清免疫学法和分子生物学法,血清免疫学法有酶联免疫吸附(ELISA)法，ELISA是用于疫病检测和监控的常用方法，但由于TTSuV具有高度基因变异性，不同基因亚型抗体间存在交叉反应，用它对基因变异进行分析时准确率较低，不能完全反映体内基因变异情况，更重要的是ELISA法的漏检率较高。除此之外，由于感染时间较短而尚未产生抗体也可造成ELISA实验结果的假阴性。

目前用于TTSuV检测的分子生物学方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滚环扩增等方法。常规PCR和套式PCR方法均根据目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非编码区来设计引物，对核酸进行检测。滚环扩增法是以任意的寡核苷酸作为引物，在恒温下以滚环扩增待测环状DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度较低，用普通PCR一轮难以扩增出目的片段，需加大循环数，但这样会使引物非特异性结合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了单次扩增“平台期效应”的限制且保证了反应的特异性，但是需要进行第二次PCR，引起交叉污染的几率较大。普通PCR敏感性较差，巢氏PCR、半巢氏PCR和滚环扩增耗时较长，且这些传统的PCR技术只能对基因的检测做定性分析，无法精确的定量所检测出的基因数量，大大制约了PCR技术的应用。