[发明专利]一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用

说明书

技术领域:

本发明涉及分子生物学及环境生物技术领域，具体地说，是涉及一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组质粒的构建方法,从而应用于环境中多环芳烃的存在及含量的检测。

背景技术：

多环芳烃化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的一类碳氢化合物，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的裂解和不完全燃烧。目前已知的PAHs约有200种，广泛分布于人类生活的环境中。PAHs引起的环境污染越来越受到人们的重视，它已成为许多国家的优先监测物。1976年EPA列出了16项PAHs为优先控制污染物。1990年我国提出的68种水体优先控制污染物中有7种属于PAHs。多数的PAHs有致癌性，流行病学研究表明PAHs通过皮肤、呼吸道、消化道等均可被人体吸收，可诱发皮肤癌、肺癌、直肠癌、膀胱癌、白血病等（BoffettaP,JourenkovaN,Gustavsson P.Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons.Cancer Causes Control,1997,8(3):444-472.）。一些PAHs还有免疫毒性、生殖和发育毒性。值得注意的是，绝大多数PAHs在体内的代谢产物，其致突变性和致癌性较之原型化学物强数十至数千倍，对人体造成的危害更为严重。

PAHs毒性作用的机理为，PAHs可诱导机体细胞内芳香烃受体（AHR）的表达，同时作为配体与AHR结合使之激活，转位于核内后与核中的芳香烃受体核转位子蛋白（ARNT）结合，形成配体-AHR-ARNT复合体，然后结合于特异基因上游的芳香烃受体反应元件（AhRE），从而导致特异基因如细胞色素P4501A1和1A2等的表达增强，最终通过代谢活化产生毒性作用。由此可见，PAHs类化合物的毒性大小与其诱导AHR能力及活化受体结合AhRE的能力有密切相关性,因此测定PAHs类化学物诱导AHR的能力对于评估其毒性及环境浓度具有主要的参考价值。

如何高效、快速地检测环境中的PAHs受到了国内外政府部门及相关科研工作者的关注。目前，环境中的PAHs的检测方法主要为化学和生物两大类方法：前者如分光光度法及色谱法，仪器设备大型昂贵、样本前处理复杂，且无法检测未知污染物；后者如细胞增殖实验等，过程繁琐、耗时长、且对操作人员有较高的技术要求，并且上述两种方法都不能准确表达该环境污染物的人体效应。本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体（AHR），启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。

本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体（AHR），启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒及其构建方法，从而应用于环境中多环芳烃类物质的检测。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明利用人源性AHR基因启动子受到多环芳烃类物质上调的特性，建立一种通过检测多环芳烃类物质对上述启动子的激活情况，实现对环境中多环芳烃类物质检测的方法。

本发明通过提取人AHR基因启动子，以含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因的CV060质粒为载体，插入AHR基因启动子，构建一种含有AHR基因启动子和双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。

所述的人源性AHR基因的启动子序列见SEQIDNO:1。

所述的AHR基因的启动子，获取该启动子使用的引物序列为：AHR-promoter-P1：

TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC，SEQIDNO:2；AHR-promoter-P2：

CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，SEQIDNO:3。