[发明专利]一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法

权利要求书

1.一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其检测体系中包括野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物、上述等位基因特异性蝎形引物的共用引物，其特征在于：

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物具有相同的3'-端延伸或扩增方向；

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物和共用引物存在于同一个反应体系中；

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物3'-末端与其基因型序列完全匹配，并通过此3'-末端识别基因型。

2.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物是单链型等位基因特异性蝎形引物，引物序列由探针序列区和引物序列区构成，并且，引物序列区和探针序列区通过PCR阻断剂连接；探针序列区呈亚稳定茎环结构，其中，茎部结构两末端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团，环部结构序列与引物序列区的3'-端延伸产物形成分子内杂交双链而使茎部结构解体，并释放标记的荧光信号；每种基因型的等位基因特异性蝎形引物均标记某种特定的荧光报告基团，通过PCR反应体系中的荧光信号种类和强度实现基因型的定性和定量检测。

3.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物是双链型等位基因特异性蝎形引物，引物由探针淬灭单体和探针-引物单体两条单链DNA组成；探针-引物单体由探针序列区和引物序列区构成，并且，引物序列区和探针序列区通过PCR阻断剂连接；探针淬灭单体与探针-引物单体探针序列区呈亚稳定状态，探针淬灭单体的3'-末端标记有淬灭基团，探针-引物单体探针序列区的5'-末端标记有荧光报告基团，探针-引物单体探针序列区与引物序列区的3'-端延伸产物形成分子内杂交双链而使茎部结构解体，并释放标记的荧光信号；每种基因型的等位基因特异性蝎形引物均标记某种特定的荧光报告基团，通过PCR反应体系中的荧光信号种类和强度实现基因型的定性和定量检测。

4.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物的PCR阻断剂是聚六乙二醇(HEG)，或者是三个碳原子的碳链(C3)，或者是其它PCR阻断剂。

5.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：所述等位基因特异性蝎形引物的荧光报告基团是羧基荧光素(6-FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA、ROX，或者其它类别的荧光基团。

6.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物的淬灭基团是荧光淬灭剂TAMRA、ROX、或者其它荧光基团，也是非荧光淬灭剂DABCYL、BHQ1、BHQ2、或者其它荧光基团。

7.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物中的碱基有一个或者多个硫代碱基，或者是锁核酸，或者是其它修饰碱基；等位基因特异性蝎形引物的3'-端部分碱基是硫代碱基，或者是锁核酸，或者是其它修饰碱基；等位基因特异性蝎形引物的3'-末端碱基倒数第2位和/或第3位碱基进一步引入与待检测核酸序列错配的碱基，或者在其它位置引入错配碱基。