[发明专利]一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，是一种基因单碱基变异(即：基因型)的检测方法，可以对基因的单核苷酸多态性和单碱基突变等基因型进行准确检测。 

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是指基因组DNA序列中某个特定碱基发生了转换、颠换、缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且，任何一种等位基因的群体频率不小于1%。SNP在人类基因组中分布广泛，并且，某些SNP可直接影响蛋白质功能和遗传稳定性等。对基因组SNP的分析是研究个体、系谱和人种特征、疾病风险预测和预防、多种疾病个体化治疗的重要线索。据估计，大约有10⁵个SNP分子标记被用于基因功能及疾病相关性的关联研究。2001个，SNP协会(The SNP Consortium)构建了1.42x10⁶个SNP、密度达到1个SNP/1.9kb的人类遗传图谱，这对开展致病基因的定位和人类起源与进化研究非常重要。基因点突变(genetic point mutations)是指基因组DNA序列中某个特定碱基突然发生的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因点突变同样包括某个特定碱基的转换、颠换、缺失和插入等变化。基因虽然稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的，在一定条件下的基因也可从原来存在的形式突变改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这种基因叫做突变基因，于是后代的表现中也就突然地出现在祖先从未有的新性状。SNP与基因点突变的区别在于：多态性是一个群体性概念，多态性在群体中的频率不小于1%，否则就叫突变(小于1%)；SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异是单碱基；一般来说，SNP是全部体细胞一样的基因型，而基因突变则往往只是部分体细胞或少量体细胞的变化；如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是，只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系，达到1%就是多态性了。可见，SNP和基因点突变均是基因组DNA特定碱基发生了转换、颠换、缺失和插入等变化，二者在基因组DNA序列的变化上具有共性，只是二者在群体中具有不同的发生频率，前者不小于1%，后者则小于1%。正是由于SNP和基因点突变在序列变化上的相似性，因此，SNP和基因点突变统称为基因变异(genetic variations)或基因单碱基变异(genetic single-base variations)。但是，在文献报道中，SNP也往往被部分研究者称之为基因突变。SNP及基因点突变等基因单碱基变异与人类多种疾病的发生、发展和预后相关，目前，上述基因单碱基变异的检测已经广泛应用于疾病预防和预测、个体化治疗、预后判断等生命科学的多个领域，在上述应用领域中，基因单碱基变异检测技术的方法学特征，如准确度、特异性、灵敏度和线性范围等方法学参数直接决定其临床实际应用价值。 

目前，基因单碱基变异检测的基本方法已多达20余种，根据其基本检测原理，可分为DNA链构象分析、限制性内切酶片段分析、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)、核酸测序、生物芯片与生物传感器等技术。上述各种检测原理均演变出多种方法，每种方法均具有各自的优缺点。例如，基于DNA链构象变化的单链构象多态性(PCR-SSCP)和变性高效能液相层析(Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)等方法的优点在于检测成本低，适用于大样本筛选。但是，上述方法操作烦琐，需要PCR扩增和凝胶电泳等多个步骤，易导致样本交叉污染；DNA片段长度增加，检测灵敏度急剧下降；易出现假阴性和假阳性结果；无法获得碱基变异的具体位置和碱基变异类型，必须通过后续技术手段确认上述变异信息(如：核酸测序)。核酸测序、生物芯片和生物传感器等技术则需要事先对待分析物进行PCR扩增，同时，存在检测成本高或通量低等问题。限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)为代表的限制性内切酶片段分析方法则受到限制性内切酶位点存在与否的限制，同时需要凝胶电泳方式判断结果。在上述多种检测方法中，AS-PCR方法是最常用的方法之一。 

AS-PCR方法检测基因型的基本技术原理主要有两类，分别是等位基因特异性引物(allele-specific primers)和等位基因特异性探针(allele-specific probes)。