[发明专利]靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺

权利要求书

1.靶特异性双突变体融合蛋白质，所述的融合蛋白质从N末端到C末端包括：首位氨基酸为谷氨酰胺(Glu)的、且第六位氨基酸被修饰的促性腺激素释放激素的氨基酸残基1-10以及截短的绿脓杆菌外毒素A氨基酸残基，优选氨基酸序列为SEQ ID NO.3。 

2.根据权利要求1所述的融合蛋白质，所述的截短的绿脓杆菌外毒素A氨基酸残基为PE40、PE38、PE35、PE23或已知结构片段，也可以是突变其最后4个氨基酸为KDEL的PE40、PE38、PE35、PE23已知结构片段。 

3.根据权利要求2的融合蛋白质，其中所说的蛋白质由Met+TrxA+His Tag+Sumo蛋白酶识别序列+mGnRH+突变的PE片段组成。 

4.根据权利要求1的融合蛋白质，其中所述的促性腺激素释放激素的氨基酸残基第6位被修饰，包括促性腺激素释放激素的第6位Gly被D-Trp或其他氨基酸取代。 

5.根据权利要求4的融合蛋白质，所述的氨基酸残基第10位Gly被乙酰化。 

6.融合蛋白重组基因，它的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。 

7.根据权利要求1的融合蛋白质，其中所说的融合蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。 

8.根据权利要求1-6所述的融合蛋白质，其中所说的嵌合毒素蛋白质是以DNA融合和重组技术制备的。 

9.权利要求1-6所述的融合蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。 

10.权利要求6所述的融合蛋白质的制备方法，包括如下步骤： 

(1)构建携带重组融合蛋白双链表达基因的可表达质粒载体，所述融合蛋白重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2； 

(2)融合蛋白质的表达：将携带重组基因质粒转化至大肠杆菌中表达； 

(3)将菌体破碎，离心取上清即为融合蛋白粗提物；在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化； 

(4)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金属螯合介质将标签部分与目的蛋白分离、纯化。 

11.根据权利要求10所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的纯化为：粗提物经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0～0.5M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分；目的组分峰部分经中空纤维超滤器作用20-40分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡过的XK1.6×10cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的缓冲液(20mM Tris·HCl，pH8.0，200mM咪唑)洗脱，收集目的蛋白峰部分。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的纯化为：将收集目的蛋白峰部分并稀释10倍，利用SUMO酶切目的蛋白，30℃，4hr，并再次进行IMAC液相色谱，收集蛋白质流川峰部分并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用，得到纯化的融合蛋白质。 

13.根据权利要求9所述的融合蛋白质的制备方法，其特征在于所述的携带重组融合蛋白双链表达基因的可表达质粒载体的结构如图1所示。