[发明专利]靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，本发明总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质的新型制备工艺。更具体地说，本发明涉及肿瘤特异性治疗药物人体促性腺激素释放激素突变体(mGnRH)与重组绿脓杆菌外毒素A截短片段或其突变体(PE38m4a)融合蛋白质的基因重新构建和纯化的制备工艺。

背景技术

为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，在中国专利CN200810051112.4中构建并表达了以突变的GnRH为导向，以截短并在C端进行突变的绿脓杆菌外毒素A为细胞毒性剂的双突变体融合蛋白质，其基本原理是在肿瘤的发生和发育过程中，许多肿瘤细胞都在其表面上过量表达促性腺激素释放激素受体蛋白质(GnRHR)，因此，可将某些细胞毒性剂(如绿脓杆菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的GnRH分子上，以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。

作为细胞毒性剂的绿脓杆菌外毒素A(PEA)(参见美国专利US4,545,985和中国专利申请CN200810051112.4)是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PEA分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PEA分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域：负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区)；负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区(II区)；以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区)。其中I区包括介导细胞结合的Ia区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。可以使用生物化学或重组DNA技术修饰PEA分子，以制备PEA分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PEA片段，例如，一般将删去了PE分子中Ia区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-A蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ia和大部分Ib区(氨基酸365-380)后，即PE38毒素分子，该分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性(例如参见Hwang et al.，Cell48：129-136,1987；美国专利4,892,827和欧洲专利0261671)。同时，如果将PE38分子中C末端氨基酸RKEDL进行突变为与内质网、高尔基体结合密切的KDEL则细胞活性能够提高10倍以上。

许多现有技术文献已描述了PEA与各种生长因子、抗体、激素或CD4融合，以产生可选择性地导向并杀伤具有不同细胞膜蛋白(受体或抗原)之靶细胞的杂交蛋白质的方法。美国专利5,428,143公开了用于选择性杀伤HIV感染之细胞的杂交蛋白质及编码该杂交蛋白质的嵌合基因的构建。其中所说的杂交蛋白质由含有HIV结合位点的人CD4和可杀死HIV感染之细胞毒性蛋白质(PE40)组成。

作为与本发明更为相关的现有技术，PCT国际专利申请WO93/15751公开了将促性腺激素释放激素(GnRH)肽直接偶联到绿脓杆菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白质分子。据称，投用这样的嵌合分子可导致脑垂体中携带GnRH受体的细胞的破坏，并伴有性激素分泌的降低，因而可望将其用于动物不育化及抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。

与本发明直接相关的是本申请人持有的中国专利CN200810051112.4提供了一种由突变的人促性腺激素与重组绿脓杆菌外毒素A突变体融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的突变的人促性腺激素部分作为导向剂，可与表面上具有相应激素受体的外周性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的绿脓杆菌外毒素部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。其中所说的作为导向的激素是突变的促性腺激素释放激素(mGnRH)，其中所说的重组绿脓杆菌外毒素是PE38KDEL(PE38m4a)。

发明内容

根据本申请人持有的中国专利CN200810051112.4，本发明在具体基因工程操作和产物纯化方面进行了进一步发明改造，使之结构更忠实于GnRH天然结构，纯化工艺更简单且经济实用，收率显著提高。

根据这一发明的一个优选实施方案，其中所说的mGnRH是以人工体外基因合成的形式连接到PE分子中相当于Ia区基因的位置。

根据这一发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的mGnRH基因是以大肠杆菌偏性密码子为主体的基因形式合成的。