[发明专利]一种诱导多能性干细胞的培养体系

说明书

本发明提供一种用于诱导多能性干细胞的培养基，所述培养基为LBX液体培养基，所述干细胞为猪干细胞、小鼠干细胞、猴干细胞或人干细胞；本发明还提供了使用本发明的培养基诱导多能干细胞的方法。本发明首次发明一种可以很好地提高多种诱导多能性的诱导效率的培养基。该培养基成本较低。本发明诱导的诱导多能性干细胞更倾向于小鼠样的状态，可以单个细胞传代，有利于大规模的扩增和后临床应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导多能性干细胞的培养体系，具体地，本发明涉及一种诱导多能性干细胞的培养体系，其制备方法及其应用。

背景技术

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）和人胚胎干细胞的建立开创了生物和医学的新领域，胚胎干细胞以自我更新和向各个胚层细胞分化的能力为研究个体发育和细胞分化提供了有力的工具，并在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景，很快就应用于细胞治疗和疾病模型研究，它可以为人类无法自身修复的疾病（帕金森，糖尿病等）提供组织再生的替代细胞。

猪的胚胎干细胞的建立将对农业生产和生物医学起着至关重要的作用。但是目前为止还没有一株被承认的猪胚胎干细胞系被建立。在这近20年的猪胚胎干细胞研究过程中，大家在一直探索和追寻怎样才能建立出猪的胚胎干细胞并且解释猪胚胎干细胞无法容易建立的原因。最成功的猪胚胎干细胞系是在1990年被Evan等人建立，可以传10代左右，但之后会呈现上皮样细胞的生长。之后经过了一系列的努力，但没有一株胚胎干细胞系被认可，分化能力较差，更没有嵌合能力。虽然有报道猪的依赖于Activin/Nodal信号通路的上胚层干细胞系被建立，但是无论是分子标记的表达还是分化能力都不是很明确。

在没有成功的细胞系被建立时，大家都在猜测各种各样的原因，比如猪胚胎的发育时程问题，猪胚胎的着床问题，合子基因问题，多能性基因表达和饲养层等问题，但是这一切都没有好的解决手段或是针对性的分析方法，一切还是停留在描述的阶段。

自小鼠诱导多能性干细胞（induce pluripotent stem cells,iPS）细胞建立之后，人们在想是否可以通过外源基因导入的手段来建立猪的多能性干细胞系。2009第一株猪iPS细胞系被建立，之后得到多个实验室的重复，但是分子表达标记有些差异，尤其是针对SSEA1和SSEA4，但令人失望的是外源基因的表达是维持多能性状态所必须的，虽然有报道可以进行嵌合体实验，至今却没有得到其他实验室的重复。更令人奇怪的是猪iPS细胞的核移植胚胎发育率远远低于正常的体细胞，并且克隆胚胎的体内发育率更是极低，极少的胎儿能够正常出生。

虽然很多实验室进行了小分子的添加来诱导多能性干细胞。但是效果不甚理想，针对上述问题，本发明首先对诱导的培养体系的摸索和优化，能够较高效率的获得猪iPS，并且这些猪iPS更倾向于小鼠样的克隆，可以单个细胞传代，有较高的发育潜能和更好的转基因效率。由于小鼠，猴子和人的细胞也存在诱导效率较低的问题，因此，当前存在能诱导多能性干细胞并提高其诱导效率的培养基的需要。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于诱导多能性干细胞的培养基，本发明的另一个目的是提供该培养基的制备方法及其应用。

一方面，本发明提供了一种用于诱导多能性干细胞的培养基，所述培养基为LBX液体培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐及其它组分；

其中，所述氨基酸包括50-150mg/L的L-精氨酸盐酸盐、10-20mg/L的L-组氨酸盐酸盐一水物、25-50mg/L的L-异亮氨酸、25-50mg/L的L-亮氨酸、40-80mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、7-15mg/L的L-蛋氨酸、18-40mg/L的L-苯丙氨酸、17-40mg/L的L-丝氨酸、17-60mg/L的L-苏氨酸、2-8mg/L的L-色氨酸、15-50mg/L的L-酪氨酸二钠盐和10-60mg/L的L-缬氨酸；