[发明专利]一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向磷酸化蛋白质组学技术领域，具体涉及应用于磷酸化蛋白质组样品处理方法。

背景技术

迄今为止，蛋白质磷酸化被发现是一种普遍发生的蛋白质翻译后修饰，它调控着大约30%的真核细胞蛋白质组。作为一种重要的翻译后修饰，可逆的蛋白质磷酸化在细胞代谢调节中发挥着重要的作用，例如细胞分化，细胞增殖，细胞凋亡和信号传导等。各种各样的胞内、胞外刺激都会引起细胞内磷酸化水平的非正常变化，而这恰恰是许许多多人类疾病发生的诱因。因此，为了系统性地理解复杂多变的细胞行为，深入的研究磷酸化蛋白质组已经成为了关键任务。最近，质谱技术在生物医学应用上的快速发展使得其已经成为了磷酸化蛋白质组学研究的重要工具，仅仅单次的质谱鉴定分析就可以获得20,000多磷酸化位点的信息。

对于磷酸化蛋白质组学研究而言，样品处理阶段是关乎下游质谱鉴定成功与否的重要步骤。常用的样品处理方法的基本流程主要包括以下几步：细胞裂解，蛋白质提取（包括可选的蛋白沉淀），蛋白质酶解和磷酸肽的富集（文献1.Albuquerque,C.P.et al.A Multidimensional Chromatography Technology for In-depth Phosphoproteome Analysis.Mol.Cell.Proteomics7,1389-1396(2008).文献2.Zhou,H.;Ye,M.et al.Robust phosphoproteome enrichment using monodisperse microsphere–based immobilized titanium(IV)ion affinity chromatography.Nat.Protoc.8,461-480(2013).）。如上步骤通常都是需要各自独立完成，这就势必会导致样品处理阶段繁琐费力和低通量。因此，很有必要发展一种快速高效的样品处理方法，以适用磷酸化蛋白组学的快速分析。

许多研究都在致力于优化样品的前处理阶段，以适应高通量蛋白质组学研究的要求，与此同时，这些年来，大多数的研究多关注的是较费时的蛋白酶解阶段。高压、超声、微波、固定化酶和表面活性剂均被用来加速蛋白质的酶解（文献3.Olszowy,P.P.,Burns,A.&Ciborowski,P.S.Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.Anal.Biochem.438,67-72(2013).文献4.López-Ferrer,D.et al.Ultra Fast Trypsin Digestion of Proteins by High Intensity Focused Ultrasound.J.Proteome Res.4,1569-1574(2005).文献5.J.et al.Fast-Response Proteomics by Accelerated In-Gel Digestion of Proteins.Anal.Chem.75,1300-1306(2003).文献6.Reddy,P.M.et al.Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions.J.Am.Soc.Mass Spectrom.21,421-424(2010).文献7.Dycka,F.et al.Rapid and efficient protein enzymatic digestion:An experimental comparison.J.Electrophoresis33,288-295(2012).文献8.Yu,Y.-Q.et al.Enzyme-Friendly,Mass Spectrometry-Compatible Surfactant for In-Solution Enzymatic Digestion of Proteins.Anal.Chem.75,6023-6028(2003).）。在众多的技术中，借助于高浓度的酶无疑是一种很直接的用来缩短酶解时间的手段。曾有研究指出，使用越高比例的酶/蛋白比，蛋白水解的速度就会越高（文献9.Hustoft,H.K.et al.Critical assessment of accelerating trypsination methods.J.Pharm.Biomed.Anal.56,1069-1078(2011).）。但是，令人不甚满意的是，同样，较多的自酶解肽段也会随之产生，这就给后续的质谱鉴定造成一定的困扰。因此，为了避免胰酶自酶解现象的干扰，在蛋白质组学研究中，通常推荐使用酶/蛋白比例为1/25，这就意味着酶解时间势必要加长至过夜酶解，以弥补酶解效率过低造成的酶解不足现象。但是，固定化酶的使用却可以大大降低胰酶的自酶解程度，从而解决这一难题（文献10.Sun,L.et al.Coupling Methanol Denaturation,Immobilized Trypsin Digestion,and Accurate Mass and Time Tagging for Liquid-Chromatography-Based Shotgun Proteomics of Low Nanogram Amounts of RAW264.7Cell Lysate.Anal.Chem.84,8715-8721(2012).文献11.Li,D.et al.Functionalization Strategies for Protease Immobilization on Magnetic Nanoparticles.Adv.Funct.Mater.20,1767-1777(2010).）。由此可以发现，借由高浓度酶促进蛋白酶解这一方法存在一定的可能性。尽管如此，固定化酶的使用仍然没有趋于普遍化，这极有可能是因为操作的不便利性以及固定化酶表面较高的非特异性吸附性能。而在磷酸化蛋白质组学分析中，必备的磷酸肽富集这一步骤的存在，使得高浓度胰蛋白酶促进蛋白快速酶解这一思路成为可能。本发明首次利用该思路，借助于高浓度的胰蛋白酶，将繁琐的样品处理过程中的细胞裂解、蛋白质提取和蛋白质酶解综合于一体，实现了细胞裂解和蛋白酶解的相互促进，从而保证快速、高效、高通量的实现磷酸化蛋白质组学样品的预处理。