[发明专利]鉴别肝素中牛基因来源的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用

权利要求书

1.一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，包括一对引物和一条TaqMan探针，其特征在于，所述一对引物分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1中所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，其特征在于，所述TaqMan探针SEQ ID NO.3的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭集团。

3.根据权利要求2中所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，其特征在于，所述5’端连接的荧光报告集团为6-羧基荧光素，所述3’端连接的淬灭集团为6-羧基四甲基诺丹明。

4.一种如权利要求1所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1）选择牛线粒体基因中特异和保守的Bov-A2基因的保守序列片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

2）根据牛特异和保守的线粒体基因保守序列的特点，应用Primer Express3.0软件和DNAStar中的PrimerSelect软件，设计合成待测引物和探针；

3）引物和探针的合成使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

4）探针合成同时进行两端标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM（6-羧基荧光素），3’端标记的淬灭基团是TAMRA（6-羧基四甲基诺丹明）；

5）将设计合成的引物和探针进行最佳配对筛选实验后，得到上述的引物和探针。

5.一种如权利要求1所述的鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂的应用，所述一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂可用于制备荧光定量PCR标准化试剂盒。

6.一种鉴别肝素中牛基因来源的生物检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

A.待检测肝素的前处理

（1）将粉末状肝素样品0.03g加至灭菌离心管中，向管中加入1ml无酶水，

振荡混匀，离心机3500rpm，30s，100℃水浴5min，放冷至室温；

（2）枪头反复吸取搅拌至样品溶解，从溶解的样品溶液中取10μl至一新的灭菌离心管中，再加入990μl无酶水，振荡混匀，用1ml注射器使溶液通过45μm微孔滤膜过滤；

（3）从上一步得到的溶液中取45μl溶液，加入0.7μl试剂肝素酶，振荡混匀，28℃水浴18h，得到待测肝素样品；

B.荧光定量PCR

（1）PCR反应体系

荧光定量PCR采用25μl体积反应液，反应扩增体系与扩增条件按下述反应参数进行：

实时荧光定量PCR反应总体积为25μl，向反应管中加入下列组分，反应体系为：

MIX12.5μl上游引物F0.5μl下游引物R0.5μl探针6.5μl待测肝素样品5μl

所述上游引物F和下游引物R分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述探针是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

（2）PCR扩增条件

实时荧光定量PCR的扩增条件为：

C.结果分析和判定

（1）结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，FAM代表牛源性成分，直接读取检测结果；基线和阈值设定原则根据仪器进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准；

（2）样本检测时均设立阴、阳性对照，检测中两种对照为有效扩增时，结果判断标准如下：

Ct值大于40的样本为阴性结果：Ct值大于38或无扩增曲线，表示样品中无牛源性成分；

Ct值小于等于35的样本为阳性结果：Ct值小于或等于35，且出现明显的扩增曲线，表示样品中存在牛源性成分。