[发明专利]鉴别肝素中牛基因来源的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能鉴别肝素中牛基因来源的生物检测试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。

背景技术

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。

2010年我国肝素及其盐的出口量创历史新高，已跃居成为我国第一大西药重点出口商品。2010年，我国肝素及其盐共出口到51个国家和地区，出口集中度很高，前五大出口市场为法国、美国、德国、奥地利和意大利，所占出口比重累计高达86.32%。肝素原料药可直接被用于制成标准肝素制剂，或进一步加工制成低分子肝素原料药再制成低分子肝素制剂。标准肝素制剂和低分子肝素制剂可直接应用于临床治疗。肝素类产品主要包括肝素粗品、肝素原料药、标准肝素制剂、低分子肝素原料药以及低分子肝素制剂。

由于肝素类药物主要是运用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中在血液透析重症治疗中是唯一有效的特效药物，其使用者集中于老龄和肥胖人群，主要消费市场分布集中在欧洲、美国和日本等发达国家。国际市场对肝素原料药的需求十分强劲，主要是由于其下游产品肝素类药物市场迅速扩容，并保持高速增长趋势。预计到2015年，全球肝素类药品的市场规模将达到79亿美元，这意味着全球医药市场对肝素的需求仍将强劲增长。但是2008年的“肝素钠事件”发生后全球肝素类药物企业高度关注肝素钠原料药的质量，对通过FDA和CEP认证的肝素钠原料药需求量大幅增加，而那些不具备这项质量认证的企业今后将无法立足国际市场。因此，对于肝素钠的质量检测成为了一个热点问题，新版药典中对于肝素钠的来源检测做出了明确规定，原因如下：

肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠粘膜提取。但是由于牛等反刍动物可能携带致病性朊蛋白，从而患传染性海绵状脑病（俗称羊瘙痒病和疯牛病）。人类可能被携带病毒的动物传染而患新型克雅氏症。由于牛海绵状脑病以及其他动物病毒疾病的存在，猪来源的唯一性就成为了确保肝素安全性的一条关键要求。因此，为确保肝素供应链的安全，各国在肝素进口方面明确要求肝素原料药不允许来自于牛，同时加大了对中国出口肝素产品的质量、来源等方面的质量要求和抽检力度。故开发一种高效的检测肝素来源的试剂及方法显得尤为必要。

目前，粗品肝素中有害杂质的检测方法主要有核磁共振、高效液相色谱等方法。随着分子生物学技术的迅猛发展，PCR技术得到了快速发展。由于肝素在制备的过程中需要经过多次提取与纯化，当中的DNA会受到影响而降解为许多小片段，如果检测目的片段太大，可能在检测中无法发现阳性片段。而受电泳检测有效性的限制，一般PCR难以采纳小片段目的产物。中国专利申请号200810123709.5由黄亚红、侯亚义等人公开了一种通过巢式PCR的方法鉴定肝素中动物基因的来源。但一般的PCR方法需要对PCR产物进行凝胶电泳完成整个检测，而且通过电泳条带进行检测灵敏度偏低，当样品中基因浓度差异不大时，条带亮度很难反应出差异，进而影响对肝素中牛基因有无的判断。而且凝胶电泳检测会延长整个检测时间，拖延检测进度。因此，这种方法存在着检测灵敏度低、操作复杂等问题。中国专利申请号200910094768.9公开的鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用的发明专利中，涉及了一种能同时鉴别包含牛、山羊及绵羊三种反刍动物品种的生物检测试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。但此体系并不适用于肝素中牛基因的检测，主要原因可以归纳为以下三点：1）经多人的研究结果表明，肝素多糖对于PCR扩增酶有抑制作用，不能直接用于real-time PCR实验，必须经过一定的处理才可行；2）此专利中方法较为复杂，多重PCR不利于肝素中牛基因的检测；3）此外这种方法的反应体系为50μl，对试剂的消耗较大，大大提高了检测成本，不利于实现企业规模化检测。

发明内容

本发明提供了一种能鉴别检测肝素粗制样品的来源组成（牛基因）的荧光定量PCR检测试剂，及其制备方法和应用。本发明利用TaqMan荧光定量PCR方法克服了普通PCR的不足之处，是检测肝素原料药中的反刍动物基因的最佳方法，具有灵敏度高、线性范围广、分析时间短、操作简便、重复性好、结果直观等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：