[发明专利]一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法

权利要求书

1.一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，具体过程为：

步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；

取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；

将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中；于4℃下，16000r/min离心30min，取上清，-20℃冰箱中备用；

步骤b，蛋白酶活性测定；

步骤b1，制作标准曲线；

首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL；取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140μL 0.55mol/L的碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值；

步骤b2，活性测定；

取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入0.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入10％三氯乙酸50μL于离心机在1000rpm，4℃条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次；取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL 0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，于分光光度计680nm处测两组的OD值；

步骤c，纤维素酶活性测定；

步骤c1，标准曲线制作；

葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25mL，取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，于分光光度计490nm处测定其OD值；

表1

步骤c2，活性测定；

取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaOH和100μL显色剂DNS，其中NaOH的浓度为2mol/L，显色剂DNS的浓度为3g/L，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，利用分光光度计测定490nm处的OD值。

2.根据权利要求1所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述培养箱施以温度为25℃±1℃，光周期为16L：8D。

3.根据权利要求1或2所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，覆膜时，在顶端开口（2）先覆一层足够薄的Paraflim封口膜，用移液枪在膜上滴加100μL的液体营养物质，再覆以一层Paraflim封口膜，在盒身与膜接触处压紧贴合以防止液体营养介质外漏流失，将饥饿过的绿盲蝽放入虫室，迅速以纱布覆住底端开口，以保持通气，用橡皮筋封住，以防止绿盲蝽逃逸。

4.根据权利要求1所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述的液体营养介质为20％蔗糖、100mmol/L丝氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法为准确称取20g的蔗糖，1.05g的丝氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸馏水定容至100mL；食料灭菌后，置4℃冰箱中，不超过7天。

5.根据权利要求1或4所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述的胶卷盒两端开口，顶端开口以两层Paraflim膜覆盖，两层膜间为液体营养介质；胶卷盒瓶身为收集绿盲蝽的虫室，底端开口以纱布覆盖，并以橡皮筋固定。

6.根据权利要求5所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，所述胶卷盒外径为3.2cm，内径为3.0cm；胶卷盒材质为硬质塑料，高度为5.0cm，壁厚为0.1cm。

7.根据权利要求6所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，所述Paraflim封口膜为高弹性封口膜；所述的虫室体积为113.0cm³。