[发明专利]一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法。

背景技术

绿盲蝽是棉田的一种间歇性害虫，主要以刺吸式口器刺吸为害植物柔嫩组织，形成孔洞，造成“破叶疯”。随着转基因抗虫棉的大面积推广种植，以及棉田用药量的减少，导致转基因棉田的“非靶标害虫”-绿盲蝽大爆发，并且，逐渐从棉田继续向其他寄主迁移，威胁到了葡萄、苹果树、桃树、樱桃、梨树等果树的生长，成为多种植物的新虫害。

绿盲蝽不同于蚜虫、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物细胞的细胞质和细胞核，属于细胞取食者。取食时，先将口针插入植物细胞内或细胞间，然后通过口针的剧烈活动撕碎植物细胞同时分泌唾液，将要取食的食物变成泥浆状，再进行吸食。昆虫的唾液成分是昆虫与植物相互关系中起联系作用的纽带，因为昆虫取食植物过程中，除咬食或刺探所造成的损伤外，唾液是昆虫对植物施加影响的主要因素。植食性昆虫唾液中含有的酶类和各种有机成分，能诱导植物的一系列生化反应。研究绿盲蝽的唾液消化酶种类并测定其含量，可以一定程度揭示绿盲蝽刺吸危害爆发成灾的原因，为绿盲蝽的持续控制提供科学依据。

绿盲蝽相较于蚜虫或者烟粉虱个体较大，活动能力较强，简单易操作的唾液酶体外提取方法较少。目前，绿盲蝽唾液酶体外提取方式一般为切头处理，加入乙酸-乙酸钠缓冲液在研钵内对其进行低温研磨，离心机低温离心，取上清以待测定其唾液酶种类及含量。该方法操作相对繁琐，需要的虫量较大，对环境条件要求严格，条件不易控制，操作不当对于结果有较大影响。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，用以克服上述技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，该具体过程为：

步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；

取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；

将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中，于4℃下，16000g/min离心30min，取上清，-20℃冰箱中备用；同时，设不加绿盲蝽的对照；

步骤b，蛋白酶活性测定；

步骤b1，制作标准曲线；

首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL；取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140μL(0.55mo l/L)碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值；

步骤b2，活性测定；

取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入O.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入1O％三氯乙酸50μL于离心机在1000rpm，4℃条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次；取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL 0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，于分光光度计680nm处测定两组的OD值；

步骤c，纤维素酶活性测定；

步骤c1，标准曲线制作；

葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25mL，取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，于分光光度计490nm处测定其OD值；

步骤c2，活性测定；

取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaOH(2mol/L)和100μL显色剂DNS(3g/L)，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，于分光光度计490nm处测定其OD值。

进一步，在上述步骤a中，所述培养箱施以温度为25℃±1℃，光周期为16L∶8D。