[发明专利]一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一株提高半胱氨酸利用率的菌株高产谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是细胞内重要的抗氧化剂和主要的非蛋白巯基化合物。在大部分动物、植物和微生物的细胞与组织中，谷胱甘肽以氧化型和还原型两种形式存在，两者通过谷胱甘肽还原酶保持动态平衡从而使还原型谷胱甘肽发挥有效的生化反应。例如：谷胱甘肽通过还原，共轭或与其他非酶抗氧化剂协同以发挥抗氧化作用，清除内生或外源的氧化物质和亲电子体，维持内环境氧化还原稳态并起到细胞保护作用；作为辅酶参与氨基酸转运与代谢(如γ-谷氨酰基循环)，保持抗坏血酸复位状态并形成脱氧核糖核酸类物质和一些小分子化合物(如半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸)；此外，谷胱甘肽间接调控DNA的合成，从而调节细胞乃至组织的生长和死亡，进而对抗或诱发肿瘤，免疫缺陷，心血管疾病，肝肾疾病或神经性疾病。鉴于此，谷胱甘肽大量应用于医药保健，护肤美容，食品添加等行业。

目前GSH的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法和生物酶催化法和生物发酵法。相比之下，生物发酵法具有反应条件温和、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优势，是今后生产谷胱甘肽的主要趋势，但目前大部分研究还停留在实验室阶段，实现商业化生产的国家主要是日本。

近年来基于发酵法对GSH产量提高的方法渐渐由传统的育种策略，培养条件优化和控制转向对代谢的调控和分子机制的研究，一些数理知识的引入在发酵条件优化，发酵过程控制及动力学模型的建立上起着重要作用，近来分子生物学的发展也为研究者从分子水平探究、提高GSH产量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一，细胞内L-半胱氨酸的供应不足严重影响了谷胱甘肽的合成速度及产量。因此可以采用分子生物学方法使L-半胱氨酸大量进入细胞，最终使细胞内谷胱甘肽的合成量增加。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒，以用于构建表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒的构建方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种过表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白生物合成谷胱甘肽的方法。

本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒包括胱氨酸转运系统底物结合蛋白基因fliY序列和一个合适的载体片段；所述序列fliY如NCBI上Gene ID为948833的序列所示。

根据本发明的一个优选实施例，在胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒中，fliY连接在一个合适的载体上，通过合适的诱导剂诱导，从而使fliY过量表达，进而使合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一半胱氨酸可以大量的进入细胞，最终使细胞内谷胱甘肽的合成量增加。

根据本发明的另一个优选实施例，所述胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒包括一个卡那霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。

本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤：

A)PCR扩增获得fliY序列；

B)将fliY序列克隆入pET28a。

本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒可用于构建表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的菌株。

本发明提供的方法可用于合成谷胱甘肽。

本发明提供的合成谷胱甘肽的方法通过发酵培养本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组菌株，合成谷胱甘肽。

使用本发明提供的质粒可以构建合成谷胱甘肽大肠杆菌，可以明显地提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生产量，降低了成本和能耗，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法构建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率低限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。

附图说明

图1是PCR扩增获得的fliY的凝胶电泳检测结果，其中泳道1为fliY。

图2是BL21-fliY质粒双酶切的凝胶检测结果，其中泳道1中5350bp左右的条带为质粒

pET-28a(+)的DNA片段，800bp左右的条带为基因fliY的DNA片段。

图3是质粒pET28a-fliY的结构示意图。

具体实施方式