[发明专利]一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法

说明书

技术领域

本发明属于桑树品种育种及分子生物学技术领域，具体涉及一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法。 

背景技术

我国是蚕丝生产大国，是世界蚕业的发祥地，同时蚕桑生产在国民经济中占有十分重要的位置。桑是蚕的重要饲料，桑树品种资源的开发育种已成为越来越重要的研究课题，目前，国内外众多学者早已开始从理论和实践上开始对桑树品种资源的保存，杂交育种亲本的选择，桑树品种指纹鉴别，分子辅助育种，品种资源开发及利用等展开研究。 

迄今为止，国内外已经开展了多项经典分类研究，这些研究对桑属的亲缘关系有重大推动作用，但存在的主要问题是对种类的认识上有差距。虽然均以花柱长短作为一级分类目标，但分出来的种数差异很大，同种异名，异种同名的现象非常普遍，且分类不稳定，鉴定出来的桑属亲缘关系准确性低。 

随之，大多数学者开始采用DNA分子亲缘关系分析方法展开研究，主要采用RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP等分子标记技术，虽然取得一定的研究成果，但是取材类型及数量不足，代表面较窄，研究方法较为单一，重复性差，因此所取得的研究成果参考研究价值较低。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中中评鉴方法实验结果重复性差，不适合桑树品种的系统发育分析，不能将桑属品种进行种细分、准确性差、取材不合理参考价值等缺陷，提供一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，本方法简单易行，取材合理，能够通过系统发育分析从而确定亲缘关系的大致框架，再进一步根据框架进行居群遗传多样性分析，从而提高了亲缘关系鉴定的准确性。 

本发明通过下述技术方案实现：一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，包括以下步骤： 

（1）桑树品种的系统发育分析：

1）取材；

2）筛选对比序列；

3）桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测；

4）PCR扩增；

5）PCR检测；

6）PCR测序；

7）序列拼接、对比，鉴定进化关系；

（2）桑树品种的亲缘关系分析；

采用DNA分子标记方法对步骤7）获得的进化关系进行亲缘关系分析，获得分析结果。

本方法通过在世界范围内分布的桑种、变种及不同生态类型选材，从而构建桑树品种样本。优选采摘桑树品种春季嫩叶，取1-2位叶，放入到装有变色硅胶并且带封口的塑料袋中，内置变色硅胶使其干燥，常温下放置，如果在放置过程中变色硅胶变色，则重新更换；将桑叶样本用石英砂磨成石英粉，取0.10—0.20g粉末采用2—4倍CTAB提取液进行DNA提取，提取后的DNA进行浓度和纯度的检测，并进行复核，DNA提取、浓度和纯度检测及复核步骤为所属领域的公知常识，这里不再详述；本方法中从桑树品种样本中提取DNA后进行PCR扩增反应、PCR检测反应、PCR测序反应，所得的测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，对少数误判碱基，根据碱基峰形更正。用Clustalx1.83c软件序列对比，并依据筛选出的对比序列核rDNA内转录间隔区ITS（5SrRNA基因间隔区NTS,26S-18SrRNA基因间隔区IGS）序列确定序列范围，用Bioedit软件除去两端非ITS部分。并采用DNAstar软件分析各序列长度、G+C含量及变异位点，同源性及遗传分歧。用Modeltest V3.06和PAUP Version4.0b10软件进行碱基替换模型计算，基于模型用PAUPVersion4.0b10MP法或mrbayes软件分析系统进化关系。根据鉴定出来的桑树品种亲缘关系，进行进一步的取材。本方法通过在所鉴定品种区域进一步增大取材范围，进一步采用DNA分子标记法对待鉴定品种亲缘关系进行分析，取得分析结果，避免仅采用系统发育分析方法或者DNA分子标记方法进行分析所带来的准确性低，重复性差、取材不合理、参考性差等技术缺陷。 

进一步地，所述筛选对比序列步骤中对比序列为核rDNA内转录间隔区ITS，5SrRNA基因间隔区NTS，26S-18SrRNA基因间隔区IGS序列。 

进一步地，所述步骤桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测中取经硅胶干燥处理后的桑树品种样本0.10-0.20g，通过2-4倍CTAB提取液提取获得桑树基因组DNA并进行浓度、纯度检测及复核，通过对用于DNA提取的桑树品种的称取量及提取试剂进行了优选，有利于提高待鉴定桑树品种DNA提取效果。