[发明专利]一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用

权利要求书

1.一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于是将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制备方法包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化；将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β；将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。

2.一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取B型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N02所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N03所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化；将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β；将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白；

5）β毒素基因工程苗制备

将上述步骤中制备好的β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗在预防因产气荚膜梭菌β毒素引起的仔猪红痢中的应用。