[发明专利]一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用。

（二）发明背景

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性、产生芽胞、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。根据其产生四种致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力,将其分为五种类型,即A、B、C、D、E五种类型。产气荚膜梭菌β毒素是由产气荚膜梭菌B型和C型菌株产生的坏死、致死性毒素，可以产生溶血性的坏死，其毒性作用表现在小肠绒毛上，可引起人和动物的坏死性肠炎。

我国是畜牧业大国,猪、牛、羊是主要经济家畜,幼畜腹泻是影响畜牧业发展的重要疫病。由产气荚膜梭菌β毒素引起的幼畜出血性坏死性肠炎(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症、仔猪红痢等),在我国广大牧区流行十分严重,有较高的发病率和死亡率,给畜牧业造成了巨大的经济损失。幼畜腹泻的药物治疗不但价格昂贵、费力费工,而且效果不好，更因致病菌抗药菌株日趋增多,用药往往无效,因而免疫预防是控制这类疫病的最佳选择。临床上产气荚膜梭菌类毒素疫苗存在致病的隐患，而基因工程疫苗安全性高而且产量高、纯度高。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用，具备免疫力强、针对性好、无毒副作用、安全性好等优点。

一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，是将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制备方法包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板。

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N03所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N04所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化。将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β。将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β。

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。

本发明还涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板。

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N03所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N04所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β