[发明专利]一种基于纳米纤维支架的人体黑素细胞的培养方法

权利要求书

1.一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备生物材料的纳米纤维支架：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后溶解于溶剂中，配成重量百分比为1-10%的溶液，通过静电纺丝，制备得到厚度为30-200微米的纳米纤维支架，在真空、20-50oC下烘2-48小时；然后用交联剂对纳米纤维支架在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后用氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，再用去离子水清洗至溶液pH为中性，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时；

（2）构建细胞-纳米纤维支架复合材料：纳米纤维支架用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时；完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件进行孵化；将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以                                                个细胞/cm²的密度接种在孵化过的纳米纤维支架上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-纳米纤维支架的复合材料。

2.根据权利要求1所述的基于纳米纤维支架的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述溶剂选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜，或者溶剂为甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇或二甲基亚砜与二氯甲烷按重量配比5:1-1:1混合组成的混合溶剂。

3.根据权利要求1所述的基于纳米纤维支架的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述静电纺丝条件：电压为5-30KV、推进速率为0.1-10ml/h、接收距离为5-30cm、温度为10-50 oC。

4.根据权利要求1所述的基于纳米纤维支架的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养液由100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分混合组成。

5.根据权利要求1所述的基于纳米纤维支架的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。

6.根据权利要求1所述的基于纳米纤维支架的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述的生物相容性材料选自壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇，聚乙烯醇等。