[发明专利]一种基于纳米纤维支架的人体黑素细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，尤其涉及一种基于生物材料的纳米纤维支架的黑素细胞培养方法。 

发明背景

白癜风是一种获得性皮肤色素脱失性疾病, 表现为局部或泛发性色素脱失，以形成白斑为特征，组织学及免疫细胞化学显示其皮损表皮黑素细胞消失。白癜风在人群中发病率达到0.5-2%，白斑处因缺乏黑色素，容易被阳光灼伤甚至引发癌变，同时也会给患者带来社交忧虑引起心理疾病。传统的治疗手段包括内服药物、紫外线照射以及外科手术治疗等。但药物治疗和紫外线照射的治愈率有限。外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植、黑素细胞悬液移植等，这些治疗方法证实是有效的，但表皮移植需大面积取皮，而细胞悬液移植中细胞悬液易流失，影响疗效，且不适合大面积移植。构建生物相容性支架，将黑素细胞培养在支架上形成细胞皮片达到培养和转移一体化，能有效改善悬液移植疗法的不足之处。

利用组织工程技术、通过细胞负载与转移，为治疗白癜风提供新的途径。CN 1919352A公开了一种含壳聚糖的纳米纤维组织修复支架，但支架的机械强度低。CN 1952227A公开了以一种用于仿生细胞外基质的明胶-壳聚糖纤维支架，支架浸泡后其结构易受损。CN 101445971A公开了一种仿细胞外基质的丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维支架，丝素蛋白的引入可能引发细胞的免疫性反应。CN 103194856A公开了一种具有抗菌作用的壳聚糖-丝胶纳米纤维，用作伤口敷料。现有公开的纳米纤维支架专利主要用于组织工程的修复，尚无用于人体黑素细胞培养的公开报道。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）制备生物材料的纳米纤维支架：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后溶解于溶剂中，配成重量百分比为1-10%的溶液，通过静电纺丝，制备得到厚度为30-200微米的纳米纤维支架，在真空、20-50oC下烘2-48小时；然后用交联剂对纳米纤维支架在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后用氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，再用去离子水清洗至溶液pH为中性，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时。

（2）构建细胞-纳米纤维支架复合材料：纳米纤维支架用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以 个细胞/cm²的密度接种在孵化过的纳米纤维支架上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-纳米纤维支架的复合材料。 

所述溶剂包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜等及其与二氯甲烷的混合溶剂，混合溶剂的重量比为5:1-1:1。 

所述静电纺丝条件：电压为5-30KV、推进速率为0.1-10ml/h、接收距离为5-30cm、温度为10-50 oC。 

所述细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分。 

本发明的有益效果是：通过对所得的生物相容性纳米纤维支架材料（图1）进行表征，具有多孔结构（图2），适合细胞生长。同时具有良好的机械性能，在制备、负载、转移和移植过程不发生破碎和断裂，符合转移和移植的要求。细胞-纳米纤维支架复合材料的构建过程中，细胞在生物相容性纳米纤维支架材料上的形态良好，多孔的纳米纤维结构益于培养液的更新，从而促进了细胞的增殖，使细胞保持良好的活性（图3）。 

附图说明

图1纳米纤维支架； 

图2纳米纤维支架SEM扫描电镜照片；