[发明专利]一种强效降压磷酸肽及其制备方法

权利要求书

1.一种强效降压磷酸肽及其制备方法，其特征在于所述的磷酸肽为磷酸肽1和磷酸肽2，其分别具有如下的氨基酸序列：

磷酸肽1：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂

磷酸肽2：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂。

磷酸肽1序列中的丝氨酸Ser被磷酸化修饰；

磷酸肽2序列中的丝氨酸Ser和酪氨酸Tyr均被磷酸化修饰。

2.如权利要求1所述的一种强效降压磷酸肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：

(1)带有保护基的多肽片段的合成：先后用N，N-二甲基甲酰胺DMF、N，N-二甲基甲酰胺DCM∶氯甲烷＝1∶2的混合液浸泡RINK AMIDE-MBHA树脂，然后用20％哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，接着在树脂中加入羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH，4倍Fmoc-Met-OH摩尔数的TBTU/HoBt/DIEA/DMF溶液，将第一个氨基酸耦合到树脂上，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测反应完全，再用20％哌啶/DMF脱除羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH氨基的Fmoc保护，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测已脱除，之后依次加入Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH或Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Pyr-OH，按上述的耦合、洗涤、检测、脱保护条件进行，从而使多肽链延长，直到最后一个氨基酸Boc-Pyr-OH连接上为止，形成连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH₂；

(2)磷酸化修饰：先用亚磷酰胺试剂二苯基N，N′-二异丙基亚磷酰胺在四氮唑催化下，将含有丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、苏氨酸Thr中的一种或以上的多肽生成亚磷酸三酯，然后用氧化剂过氧化叔丁醇，将其氧化成相应的磷酸三酯：连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂；

(3)切除与沉淀：采用三氟乙酸切除溶液切除树脂并选择性地脱去保护基后，得到磷酸化的目标产物：磷酸肽1Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-LysAsp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或磷酸肽2Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂，将上述切除液吹去溶剂后，用乙醚沉淀，得到磷酸肽粗品；

(4)磷酸肽纯化：使用填装有的二氧化钛纳米粒子的磷酸化多肽纯化装置，对磷酸肽1和磷酸肽2粗品进行分离纯化；

(5)鉴定：用色谱、质谱分析技术分析鉴定磷酸肽1和磷酸肽2。