[发明专利]一种强效降压磷酸肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种强效降压磷酸肽及其制备方法，属多肽的序列改造及其化学合成制备技术领域，在医药等领域具有重要的应用价值。

背景技术

多肽类生化物质具有“剂量低、活性高、起效快、安全比高、副作用小”等小分子物质无可比拟的优点，其中麝香蛸素(Eledoisin)是从麝香蛸(Eledone)中提取得到的含11个氨基酸的多肽，具有强烈的外周血管舒张及增加冠脉血流量的作用，是已知肽类中最有效的降压物质，其效应比硝酸甘油强数千倍。因此麝香蛸素类多肽在医药等领域具有重要的应用价值。但麝香蛸素存在一个致命缺点是，很容易被体内活性酶酶解失效，作用持续时间极短，限制了其有效应用。

麝香蛸素的多肽序列为Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂，对其序列进行结构改造有望进一步提高其活性和作用持续时间，但该方面的研究目前尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于对麝香蛸素多肽序列进行改造，设计新的多肽序列，提高其降压活性、延长其作用持续时间。并提供改造后多肽序列的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

由于磷酸肽通常具有很高活性，在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置通常在带有羟基的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)上。观察到麝香蛸素多肽序列中从羧基端开始第9位氨基酸为Ser，所以本发明的序列改造设计如下：

将9位Ser进行磷酸化修饰，得到磷酸肽1的序列：

Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂

将9位Ser进行磷酸化修饰，并将4位Ile替换为Tyr，进行磷酸化修饰，得到磷酸肽2的序列：

Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂

对其进行化学合成和纯化的具体步骤如下：

(1)带有保护基的多肽片段的合成：先后用N，N-二甲基甲酰胺DMF、N，N-二甲基甲酰胺DCM∶氯甲烷＝1∶2的混合液浸泡RINK AMIDE-MBHA树脂，然后用20％哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，接着在树脂中加入羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH，4倍Fmoc-Met-OH摩尔数的TBTU/HoBt/DIEA/DMF溶液，将第一个氨基酸耦合到树脂上，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测反应完全，再用20％哌啶/DMF脱除羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH氨基的Fmoc保护，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测已脱除，之后依次加入Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH或Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Pyr-OH，按上述的耦合、洗涤、检测、脱保护条件进行，从而使多肽链延长，直到最后一个氨基酸Boc-Pyr-OH连接上为止，形成连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2或Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2；

(2)磷酸化修饰：先用亚磷酰胺试剂二苯基N，N′-二异丙基亚磷酰胺在四氮唑催化下，将含有丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、苏氨酸Thr中的一种或以上的多肽生成亚磷酸三酯，然后用氧化剂过氧化叔丁醇，将其氧化成相应的磷酸三酯：连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-lle-Gly-Leu-Met-NH2或Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2；