[发明专利]检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测细菌对氟苯尼考耐药性（floR基因）的LAMP方法。 

背景技术

氟苯尼考(Florfenicol，FF)是氯霉素的氟化衍生物，又名氟甲砜霉素，是由美国先灵葆雅公司的Nagabhushan研制的，主要用于治疗动物细菌性疾病的一种抗菌药物。氟苯尼考的抗菌机理主要是与细菌70S核蛋白体的50S亚基上的A位结合，阻碍肽酰基转移酶的转肽反应，抑制肽链的延伸，从而抑制细菌蛋白质的合成。氟苯尼考因其具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广以及无潜在再生障碍性贫血的副作用等优点，在兽医临床上广泛用于预防和治疗动物细菌性疾病。氟苯尼考在1990年首次在日本上市；1993年挪威批准该药可用于治疗鲑的疖病；1995年法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙批准用于治疗牛呼吸系统细菌性疾病；2000年我国通过了该药的审批，系国家二类新兽药，用于畜禽及水生动物的全身感染的治疗，对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。然而，氟苯尼考的长期和不当使用已导致严重的耐药问题。相关调查研究表明，细菌的耐药机制越来越复杂，细菌产生耐药性的速率远远超过新药研发使用的速率，抗生素的持续不当使用将有可能导致无药可用的局面。因此，对氟苯尼考耐药性的持续监测以及近一步深入研究氟苯尼考耐药的产生机制和传播机制，将为临床上科学使用氟苯尼考、减缓耐药菌的产生提供有价值的参考。 

目前，细菌对氟苯尼考的耐药性判定方法有以下两种：一是测定氟苯尼考对菌株的MIC值，依据该值的大小进行判定；二是进行体外药物敏感试验测定抑菌圈大小来判定。这两种检测方法都要消耗大量的实验耗材和进行繁琐的实验操作，费时费力，试验结果主要是通过肉眼观察来判定，增加了人为因素。 

细菌氟苯尼考耐药基因floR编码的蛋白是一种外输泵蛋白，能特异性的将细菌体内的氟苯尼考泵出体外，导致氟苯尼考无法发挥其抑制细菌蛋白质合成的功能，失去其抑制或杀灭细菌的作用。目前对细菌氟苯尼考耐药基因floR检测使用常规的PCR方法，该法准确性较高，但需要复杂的仪器设备，费时，成本高，灵敏度不够高，特异性不够强，扩增产物容易污染PCR仪，不适合流行病学调查中大批量检测。 

LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等 优势，目前多数建立的LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，不能进行定量，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感度高、特异性强、快速准确的检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，以实现快速、实时、定量检测细菌对氟苯尼考耐药性（floR基因）。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP引物组，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 

检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，利用LAMP引物组，在63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60min；LAMP引物组包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 

扩增反应的反应体系以25μL计，包括：2×Reaction Mix12.5μL，Bst DNA Polymerase1μL，Primer FIP40pmol、BIP40pmol、F35pmol、B35pmol，细菌质粒DNA2μL，Distilled Water补足25μL。 

扩增反应在Loopamp实时浊度仪内全程密闭监控进行。 

扩增反应后采用钙黄绿素荧光染料进行荧光检测，荧光染料在反应前加入。 

氟苯尼考耐药基因floR是细菌对氟苯尼考耐药的标志性基因，通过测定氟苯尼考对细菌的MIC，以及对细菌floR基因进行定量，形成floR基因与MIC的关联，通过LAMP方法快速测定floR基因的含量，即可判定细菌对氟苯尼考的耐药性，这将为监测氟苯尼考耐药性提供极大的便利。