[发明专利]一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法

权利要求书

1.一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备不对称的生物膜材料：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-70oC下烘0.1-5小时，使溶液表面水分挥发，形成1-10微米的致密膜；然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液，浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；用去离子水清洗至溶液pH为中性，-60~-40oC冷冻干燥8-24小时，得到不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时； 

（2）构建细胞-不对称膜复合材料：不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时；完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积浓度为5% 的CO₂、饱和湿度条件进行孵化；将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以                                                个细胞/cm²的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积浓度为5% 的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。

2.一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备不对称的生物膜材料：1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将溶液注入细胞培养板，-60- -40oC冷冻干燥8-24小时，得到多孔支架；再将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于30-70oC烘0.1-5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，用去离子水清洗至溶液pH为中性；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时；

（2）构建细胞-不对称膜复合材料：不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时；完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积浓度为5%CO₂、饱和湿度条件进行孵化；将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm²的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积浓度为5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。

3.根据权利要求1和2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇等。

4.根据权利要求1和2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。

5.根据权利要求1和2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养液由100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分混合组成。