[发明专利]一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，尤其涉及一种基于不对称的生物膜材料的黑素细胞培养方法。

发明背景

白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性皮疾病，在人群中发病率达0.5-2%，病因是人体皮肤中黑素细胞的功能丧失。白癜风表现为局部或泛发型白斑，白斑处因缺乏黑色素，容易被阳光灼伤甚至引发癌变，同时也会给患者带来社交忧虑引起心理疾病。

目前治疗白癜风主要有三类疗法：药物疗法、光化学疗法、外科手术疗法。药物疗法和光化学疗法疗效一般且副作用大，因此人们更多的关注外科手术疗法。外科手术疗法利用组织工程技术，将人体黑素细胞体外培养，培养一段时间后转移至患处，达到治疗疾病的效果。常用的黑素细胞悬液移植疗法，因其流动性强在关节处治愈率低。构建生物相容性支架，将黑素细胞培养在支架上形成细胞皮片达到培养和转移一体化，能有效改善悬液移植疗法的不足之处。

利用组织工程技术、通过细胞负载与转移，为治疗白癜风提供新的途径。CN 102648987A公开了一种将透明质酸钠-壳聚糖类复合材料制备成具有光滑面和海绵面的不对称面材料，促进上皮细胞、内皮细胞生长，但该材料未用于黑素细胞的培养。CN 1785444A公开了一种胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架材料，能诱导缺损处细胞迁移、增殖和分化，但该材料不支持黑素细胞、成纤维细胞的生长。CN 1422668A公开了一种医用微孔壳聚糖不对称膜材料，能防止术后伤口粘连，但仅仅起到伤口敷料作用。CN 103007364公开了一种脂肪族聚酯双层不对称引导组织再生膜材料，其制备过程存在有机溶剂的残留。现有不对称膜的相关公开专利主要用于伤口敷料，未涉及在黑素细胞培养中的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于不对称的生物膜材料的黑素细胞的培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于不对称膜材料的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备不对称的生物膜材料：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-70oC下烘0.1-5小时，使溶液表面水分挥发，形成1-10微米的致密膜；然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液，浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；用去离子水清洗至溶液pH为中性，-60~-40oC冷冻干燥8-24小时，得到不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时。

（2）构建细胞-不对称膜复合材料：不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积浓度为5% 的CO₂、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以                                                个细胞/cm²的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积浓度为5% 的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。

一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法，包括以下步骤：

（1）制备不对称的生物膜材料：1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将溶液注入细胞培养板，-60- -40oC冷冻干燥8-24小时，得到多孔支架；再将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于30-70oC烘0.1-5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，用去离子水清洗至溶液pH为中性；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时。