[发明专利]在水稻中高效表达Bt蛋白Cry30Fa1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种在水稻中高效表达Bt蛋白Cry30Fa1的方法。

背景技术

褐飞虱（Nilaparvata lugens ）又称褐稻虱，属同翅目（Homoptera），飞虱科（Delphacide），是一种遍布世界的迁飞性害虫，是危害亚洲稻作区最严重的害虫之一，严重影响水稻的产量及其品质，我国褐飞虱的年发生面积为1330-2000万hm²，大约占水稻种植面积的1/2。褐飞虱对水稻的危害主要表现为以下几方面：1）成虫和若虫群集于稻丛基部，刺吸水稻茎叶韧皮部中汁液，消耗稻株营养；受害重时，稻株下部变黑、腐烂发臭和瘫痪倒状。2）成虫产卵时刺伤稻株茎叶组织，形成大量伤口，促使水分由刺伤点向外散失，同时输导组织破坏，同化作用减弱，加速稻株倒伏。3）褐飞虱还是传播水稻病毒病的虫媒，可以传播或诱发水稻病害。此外，褐飞虱取食或产卵时造成的大量伤口，有利于水稻纹枯病等病菌的侵染；取食危害时排泄的“蜜露”，富含各种糖类和氨基酸，覆盖在稻株上，易招致病菌的孳生。

长期以来，主要依赖于化学农药来防治褐飞虱，但是传统单药剂控制方法已经很难满足现实生产的需求，且滥用化学杀虫剂会导致环境污染和生态环境破坏等问题。另外，褐飞虱生物型的改变、食物链的丰富以及对主治药剂吡虫啉等产生抗性的一些因素促使了褐飞虱的反复暴发。因此，世界上许多国家都在不断挖掘和利用抗褐飞虱基因，进而选育具有持久抗虫性水稻品种。

研究者陆续从水稻抗褐飞虱品种中定位了一系列抗飞虱主基因，目前为止，已经鉴定了水稻中35个褐飞虱抗性位点，其中4个已被克隆，并培育出一系列抗褐飞虱水稻品种。另外，对同翅目害虫具有控制作用的基因，还包括胆固醇氧化酶基因、大豆胰蛋白酶抑制(SKTI)基因和雪花莲外源凝集素(GNA)基因。由于GNA蛋白对人的毒性极低，但对褐飞虱、黑尾叶蝉有极强的毒杀作用，同时还能抑制蚜虫的生长，因而已经应用于转基因水稻中。这些抗性品种的推广在一定阶段缓解了褐飞虱的危害，获得了较大的经济效益，也为发展环境友好型和资源节约型农业做出了重要贡献。

然而，褐飞虱具有快速演变形成新的生物型以适应新的抗虫品种的能力，使一系列单一抗性的水稻品种往往很快就被新的生物型所危害，如IR26仅推广两年就丧失了抗性，而IR36的抗性也仅维持了8年。因此，筛选对褐飞虱具有独特杀虫机理的新型基因，结合分子辅助选择技术聚合多个抗虫基因或QTL，已成为防治褐飞虱危害和减轻抗虫品种对褐飞虱的选择压力，延长品种使用年限的首要任务。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在形成芽胞的同时能产生对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、同翅目、线虫等多种害虫具有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs），编码这些蛋白的基因称为cry或cyt基因。这些杀虫晶体蛋白具有对人畜无害、环境友好的特点。因此，广泛应用于农业、林业、卫生等领域的害虫防治，成为世界上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂；同时其杀虫基因已成功地应用到转基因抗虫植物中，是转基因抗虫植物主要的基因来源。

编码杀虫晶体蛋白的基因称为cry或cyt基因，由国际Bt杀虫基因命名委员会正式命名，主要是根据杀虫基因编码的氨基酸序列的同源性进行分类；由于氨基酸序列差异与杀虫特异性及毒力有密切的相关性，命名委员会规定与已知蛋白同源性低于95%即为新的模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html)。目前，研究者已从世界各地的昆虫、土壤和植物体表等样本中分离到数万株Bt菌株，并从中挖掘出从Cry1～Cry73类杀虫晶体蛋白，但是对昆虫高毒力Bt菌株和Cry蛋白却鲜有报道。

Bt及其杀虫晶体蛋白的应用主要集中在三个方面：1）直接工业化生产；2）构建工程菌，进而转化生产；3）培育转基因抗虫植物。目前商业化应用的Cry蛋白主要有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B，Cry8A，Cry8B和Cry34/Cry35。Bt及其杀虫晶体蛋白对植物害虫、卫生害虫的绿色防治做出了巨大贡献。