[发明专利]一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于杂交种子纯度鉴定技术领域，具体涉及一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定的SSR引物及鉴定玲珑节瓜杂交种子纯度的方法。 

背景技术

种子纯度是种子质量检验的最主要的质量指标之一。植物新品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的测试(简称DSU测试)是农业部植物新品种保护办公室对申请品种授予新品种权进行实质审查最重要的工作内容。 

玲珑节瓜是杂交一代节瓜品种。制种时，亲本(父本和母本)繁种田、一代杂种制种田与其它品种或类型的节瓜、冬瓜材料须严格隔离，隔离距离1000米以上。制种时母本和父本按照一定比例分行种植，母本雌花开花前，母本植株逐一去雄。开花期利用昆虫媒介或者人工辅助的方法将父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂交种子。如果母本去雄不彻底，母本的花粉就有可能落到母本的雌花柱头上产生自交种子，出现假杂种，这是制种过程导致种子不纯的最主要原因；此外，如果父本行植株未能及时铲除，也有可能将父本果实混入杂交果实，造成混杂。因此杂交种子在销售前必须做纯度鉴定，符合国家对杂交种子纯度标准的才能出售给客户。 

传统的节瓜杂种纯度鉴定都是在田间进行，根据植株的形态特征对杂种群体进行纯度识别，由于多数特征性状需要在结果期才能识别，杂种纯度鉴定通常需要2-3个月方可完成，所需周期长，并需占用土地和人力，且鉴定结果受环境影响大，不良气候、病虫为害和栽培水平均会使纯度鉴定准确性降低。20世纪后期，随着分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。目前，现有技术中仍未建立对节瓜杂交种子纯度鉴定方法。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记，特异性强。 

本发明的目的还在于提供一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定玲珑节瓜杂交种子纯度。 

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304-R，所述上游引物ChQSSR304-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304-R的具体核苷酸序列如下： 

ChQSSR304-F:5’-GGGGCCTGAAAATGAAGTAA-3’(SEQ ID NO.1)； 

ChQSSR304-R:5’-AAAACATGGTCTAGGGCTATGC-3’(SEQ ID NO.2)。 

该标记带型清晰、重复性好，对PCR扩增产物进行凝胶电泳时，电泳结果显示，引物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记SSR304185(序列如SEQ ID NO.3中所示)和156bp的母本特异性标记SSR304156(序列如SEQ ID NO.4中所示)。 

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，含以下步骤： 

(1)提取节瓜幼苗的基因组DNA； 

(2)以节瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物ChQSSR304进行PCR扩增； 

(3)对扩增产物进行凝胶电泳； 

(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记ChQSSR304₁₈₅以及156bp的母本特异性标记ChQSSR304₁₅₆。 

在上述各步骤中： 

本发明步骤(2)中PCR扩增时采用的反应体系优选为：基因组DNA10ng，10×PCR buffer(含Mg²⁺):2μL，2.5Mm dNTP：1.5μL，SSR引物ChQSSR3040.25mmol·L^-1，Taq酶1U，ddH₂O补足至20μL。