[发明专利]一种脊髓性肌萎缩症SMN基因的敲除方法及细胞模型

说明书

 

技术领域

    本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症SMN基因的敲除方法及细胞模型。

 

背景技术

脊髓性肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种常染色体隐形遗传的神经肌肉疾病，病理特征显示为脊髓前角运动神经元变性，患者肢体近端和躯干肌肉无力和萎缩，最终导致呼吸衰竭甚至死亡。其在活产婴儿中发病率为1/6000~1/10000,人群携带率为1/40~1/60，居致死性常染色体隐形遗传病的第二位，仅次于囊性纤维化。该病的发生，给患者带来巨大的的身心痛苦，同时也给家庭带来沉重的负担。

随着分子生物学和遗传学的发展，现在研究发现：运动神经元存活（SMN）基因是SMA的主要致病基因。该基因定位于5q11.2-13.3。人类染色体组中SMN基因有多个拷贝：一个SMN1（位于端粒侧SMN）和多个SMN2（着丝粒侧SMN）。SMN1基因的全长转录本fl-SMN可以编码一种含有294个氨基酸的功能稳定的全长蛋白质（SMN蛋白）。而SMN2较SMN1对比来看编码区存在着一个单碱基的(840C→T)的变化，这一改变导致细胞剪切机制的选择性的跳跃形成的转录本缺失7号外显子，形成一个截短的mRNA异构体“Δ7SMN”，编码不具有生物功能并迅速降解的“截短蛋白质”，只有10%-20%的 SMN2前mRNA发生正常剪切表达SMN(SMN-fl)蛋白，此为SMN2的补偿作用。目前认为，SMN1基因改变导致SMN蛋白水平下调是引起SMA发病的根本原因，SMN2被普遍认为是SMA的修饰基因，其拷贝数和剪接效率则与疾病的严重程度相关。约95%的患者为SMN1纯合缺失或SMN1转化为SMN2导致SMN1缺失。

针对SMN1基因缺失后为何导致脊髓前角ɑ运动神经元变性而患SMA疾病，目前机制尚不明确。而SMA转基因模型制作迄今技术不成熟且花费巨大。因此，若能应用基因敲除技术特异性敲除SMN1基因，体外构建SMA病理细胞模型，则能为SMA病因及发病机制的深入研究及高通量筛选治疗SMA药物提供新的平台。

锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)是近年来兴起的一种基因敲除技术，其为一种人工改造的核酸内切酶，由一个人工锌指DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，锌指结构能特异性地结合DNA序列，每个锌指识别三个连续的DNA碱基，非特异性核酸内切酶行使剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI羧基端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到 DNA 靶向切割目的。针对靶序列设计8~10个锌指结构域，将这些锌结构域连在DNA核酸酶上，便可实现靶序列的双链断裂(Double strand break, DSB)。当两个ZFN切割靶位点，制造出双链断裂以后，细胞的修复机制被激活，包括同源重组修复和非同源末端连接(Non-homologous end-joining, NHEJ)。如果DNA修复是非同源的末端连接，将会有大约70%的概率通过随机删减或添加可以引起移码突变的碱基，或无义突变引起蛋白质长度变化，从而导致基因敲除。到目前为止，从包括中国专利在内的有关资料检索表明，利用ZFNs技术敲除SMN基因，建立SMA疾病的细胞模型，尚未见到相关报道。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于将脊髓性肌萎缩症SMN基因敲除的锌指核酸酶，及其质粒载体，以及所得到的细胞模型。本发明应用ZFN技术敲除SMN基因，采用脂质体转染方法，实现了建立脊髓性肌萎缩症（SMA）疾病的细胞模型，可以应用在脊髓性肌萎缩症致病机理的研究中，同时也为抗脊髓性肌萎缩症药物的高通量筛选提供细胞模型。

本发明提供了一种用于SMN基因敲除的表达锌指核酸酶的质粒载体，是指分别插入有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示碱基序列的质粒。

进一步地，所述的质粒是指pAVX。

进一步地，所述的碱基序列的下游还连接有FokI碱基序列。

另一方面，本发明提供了上述的质粒载体在哺乳动物细胞中表达出的锌指核酸酶。