[发明专利]快速检测沙门氏菌的抗体试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明隶属生物技术检测领域，具体涉及一种能特异、便捷﹑快速检测所有沙门氏菌的单抗腹水试剂以及应用该试剂的检测方法。

背景技术

1.沙门氏菌属简述

1885年Salmon于猪霍乱病流行时分离到猪霍乱杆菌。1888年Gartner从急性胃肠炎者分离到肠炎杆菌，到1900年为纪念猪霍乱杆菌的发现者美国细菌学家Salmon，将此类细菌命名为Salmonella（沙门氏菌）。沙门氏菌是一类广泛分布于自然界，肠杆菌科中的一种重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。

在此之前的研究表明除雏沙门氏菌，即鸡白痢沙门菌(Salmonellap pullorum)和鸡沙门氏菌，即鸡伤寒沙门菌(Salmonella gallinarum)外,大多数沙门菌周身有鞭毛、运动活泼，而真实情况并非如此，鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌也具有鞭毛编码基因、结构和运动性。也就是说，所有的沙门氏菌都有鞭毛，从DNA一级结构的检测和序列测定得到证实。通过我们研发的针对沙门氏菌鞭毛的抗体试剂也能反应识别雏沙门氏菌和鸡沙门氏菌而进一步验证。沙门氏菌鞭毛的基本结构为基体部、钩状部和丝状部三个部分,其中丝状部由数千个结构蛋白自身装配而成。该结构蛋白称为鞭毛蛋白,包括N、C末端高度保守区和一个中间可变区,沙门菌分型H抗原表位定位于鞭毛蛋白的可变区中。沙门菌的鞭毛具有特异的抗原性,鞭毛抗原的特异性取决于鞭毛蛋白一级结构多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。沙门菌编码鞭毛蛋白的基因为fliC或fljB,鞭毛蛋白基因序列两端为N、C端保守区,中间为可变区。可变区中不同的碱基序列编码不同氨基酸序列,形成不同的抗原表位,具有特异性,被称为抗原决定区(antigenic determinant)。

2.沙门氏菌流行现状

沙门氏菌作为人畜共患致病菌，其在全球公共卫生学上都具有极其重要的地位。举例来说，目前肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20-25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%。其中鼠伤寒沙门氏菌是最常见的血清型，在国外占27.7-80%，其次为肠炎沙门氏菌占有10.3%；而我国国内状况也不容乐观，肉类沙门氏菌检出率在11-39.5%。牛、马、猪感染多呈全身感染，形成败血症，感染或带菌畜产品易引起食物中毒型沙门氏菌感染。我国禽蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9-43.7%，禽、蛋而引起鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌感染或带菌在食物中毒中占有相当的重要性，其感染病例报告逐渐有增加的趋势。

据统计在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有肠道沙门氏菌（6个亚种）和邦戈尔两个种，计有2500个以上血清型。多少年来，一直认为，除雏沙门氏菌和鸡沙门氏菌无鞭毛不运动外，其余沙门氏菌均以周身鞭毛运动，且运动活泼。因此，明确存在任何一种沙门氏菌的特异性快速检测一直是沙门氏菌研究的焦点问题。

3.单克隆抗体技术

1975年Kohler和Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，标志着单克隆抗体制备技术的成功建立。该技术基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，机体内B淋巴细胞产生相应的抗体，由于体外培养的肿瘤细胞可无限传代，若把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过小鼠脾细胞融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。鉴于其质地均一、高度特异和高亲和力，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、治疗和纯化方面已获得广泛应用。

4.沙门氏菌的检测与判定

4.1现行主流检测方法概述

4.1.1传统分离鉴定方法：按照前增菌和增菌，鉴别培养基初步分离鉴定，分离纯培养物，属和种的鉴定，血清学分群和菌型的判定等步骤。该方法准确，可重复性强，但过程相当繁琐，费时费力。

4.1.2免疫学标记检测方法：如ELISA，Dot-ELISA，免疫荧光技术，免疫磁性分离技术等。该方法能提高试验的灵敏性，而且快速，简便，特异性强，但对仪器设备要求较高，而且至今没有一种方法达到检测所有沙门氏菌的目的。