[发明专利]蛋白酶3抗体(PR3-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于临床免疫学检测技术领域，具体涉及一种蛋白酶3抗体(PR3-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法。 

  

背景技术

蛋白酶3（PR3）是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29KDa的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等多种组织成分。此外，蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制剂失活。PR3抗体是韦格拉肉芽肿病（WG）的特异性抗体。尽管其发病机制不清，但是抗PR3抗体与韦格拉肉芽肿病发病机制具有一定的相关性。另外，PR3抗体浓度与其他疾病活性密切相关，可见于原发性系统性脉管炎、慢性炎性肠炎、感染（如HIV）和其他疾病。韦格纳肉芽肿患者经治疗病情稳定后，该抗体浓度可下降，常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。PR3抗体对呼吸道有亲和性，致上下呼吸道坏死，肉芽肿形成。此外，蛋白酶3抗体（抗-PR3）在血管炎的发病中也起着重要作用，蛋白酶3抗体（抗-PR3）的检测结果在原发性小血管炎患者中检测中具备较高的临床价值。 

临床检测蛋白酶3抗体(PR3-Ab)的常见方法包括放射免疫分析法以及间接免疫荧光法等。但这些方法都存在着不足之处。放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应，是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测抗原的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异，但其却需要具备尖端复杂的设备，且成本也不低。同时，还需要特殊的预防措施，因为其要用到放射性物质。因此，如今放射免疫分析法在很大程度上已经被ELISA所取代。间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物，继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。该方法在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别；操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，只能进行定性检测，不能进行定量测定。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种具备较佳的准确度、精密度和稳定性的试剂盒。本发明是通过如下技术方案来实现的： 

一种蛋白酶3抗体(PR3-Ab)定量测定试剂盒，包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂；

所述磁分离试剂的制备步骤如下：

一、配制磁微粒缓冲液，以配制1L为例： 

1）、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12.1g和NaCl 8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解； 

2）、称取BSA 5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300 0.2 mL至容器中，充分搅拌至完全溶解； 

3）、用4M的HCl调pH，控制在pH在7.9-8.1之间； 

4）、最后用纯化水定容至1L，用0.2um滤器过滤，2-8℃保存待用；

二、制备磁分离试剂：

1）、取100mg含羧基（COOH）活性基团的磁微粒，用0.025mol/L，pH4.5-5 MES缓冲液10mL混悬；

2）、加入0.5-1mL浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min；

3）、磁分离，去上清，用0.025mol/L，pH4.5-5 MES缓冲液10mL重悬；

4）、加入0.02-0.1mg的PR3抗原，室温混悬120-240min；

5）、磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液重悬到1mg/mL，完成磁分离试剂的制备。

  

所述酶标记试剂的制备步骤如下： 

一、配制酶标记试剂稀释液，以配制1L为例：

1）、量取800mL纯化水于容器中，称取Hepes 6.06g、NaCl 8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解； 

2）、称取BSA 5g，Zncl₂ 0.1g、Proclin-300 0.2mL和MgCl₂ 0.1g于容器中中，充分搅拌至完全溶解； 

3）、用4M的HCl调pH，控制pH在7.5-8.0之间； 

4）、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用；

二、碱性磷酸酶（ALP）与PR3抗体的偶联

1）、取1mg PR3抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液2-4μL，室温静置20min，加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min；用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的PR3抗体，2-8℃保存备用；