[发明专利]一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低分子量肝素完全酶解产物的离子对反相色谱与柱后衍生结合的检测方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的线性糖胺聚糖，广泛存在于动物器官和组织中，通过与众多蛋白结合而在生物活性和生理过程中发挥着重要作用。肝素具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等生物学功能，并作为一种天然的抗凝血和抗血栓药物，广泛应用于临床疾病治疗，但在长期使用过程中，会引发诸如骨质疏松、血小板减少等副作用。低分子量肝素是肝素分级或由化学法、酶法降解而得到的分子量较小的片段，具有与普通肝素相同的二糖组成单元以及与抗凝血活性相关的五糖序列。低分子量肝素作为近年来国内外研究开发的新型抗血栓药物，与肝素相比，具有体内生物利用度高、半衰期长、副反应少、抗血栓作用强、使用方便和安全等优点，同时又可减轻或避免肝素的不良作用。

高效液相色谱是肝素分析的重要手段，具有分离效率高、分析时间短、样品需要量少、检测限低等特点。目前上市的三种主要低分子量肝素为依诺肝素钠、那屈肝素钙和达肝素钠，其中的依诺肝素钠因其特殊的非还原端结构在232nm下有特征性紫外吸收，而另外两种低分子量肝素既无强紫外吸收，又无荧光基团，故在其色谱检测前通常需要先进行衍生化，使之具有紫外吸收、荧光特性或其它一些可测定的物理化学性质。

荧光衍生与液相色谱结合具有高灵敏度、低检测限、简便可靠等特点，在糖类物质的研究中应用广泛。在肝素寡糖的分离过程中，由于硫酸基团的存在和寡糖本身不带有发色基团，使寡糖的分离和检测较为困难，需要对其进行衍生使其带上紫外或荧光基团，不仅可以提高检测的灵敏度，而且使寡糖带上的疏水基团能降低寡糖的极性，有利于其在反相色谱柱上分离。高效液相色谱中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测器高出几个数量级，更适合痕量分析。 

柱前荧光衍生是在样品分离之前进行荧光衍生，再根据衍生物性质进行色谱分离和检测。此种方法的缺点是操作过程比较繁琐，容易影响分析的准确性和重复性，衍生反应的副产物可能会对色谱分离造成较大干扰，影响分析结果。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，该方法操作简单、重复性好、分析结果准确。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物；将所述完全酶解产物经过离子对反相色谱进行分离，再进行柱后荧光衍生反应，最后进行荧光检测，分析完全酶解产物组成。

在本发明一个较佳实施例中，所述降解过程为用肝素酶I、II和III在20～30℃下降解46～50 h，降解产物经超滤膜过滤后真空减压干燥得到完全酶解产物。

在本发明一个较佳实施例中，所述离子对反相色谱法的过程为在流速为1～5mL/min下用第一流动相和第二流动相洗脱，在流速为0.1～0.8mL/min下用第三流动相和第四流动相进行柱后荧光衍生反应。

在本发明一个较佳实施例中，所述第一流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、氯化钠浓度为0.1～0.5M的第一流动相，所述第一流动相的pH值为5.0～6.5。

在本发明一个较佳实施例中，所述第二流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、氯化钠浓度为0.4～1.5M的第一流动相，所述第二流动相的pH值为5.0～6.5。

在本发明一个较佳实施例中，所述第三流动相的配制过程为将2-氰基乙酰胺溶解于去离子水中，得到2-氰基乙酰胺质量百分比为1%～5%的第三流动相。

在本发明一个较佳实施例中，所述第四流动相的配制过程为将氢氧化钠溶解于去离子水中，得到氢氧化钠浓度为0.2～1.0M的第四流动相。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光检测的条件为激发波长为346nm，发射波长为410nm。

在本发明一个较佳实施例中，所述分析过程是以8种肝素二糖标准品为对照，对低分子量肝素标准品完全酶解产物和样品完全酶解产物的色谱峰进行归属，以低分子量肝素标准品为参照，比较标准品和样品之间的异同点，分析样品完全酶解产物组成，其中8种二糖标准品分别为ΔUA-GlcNAc、ΔUA-GlcNS、ΔUA-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNAc、ΔUA-GlcNS6S、ΔUA2S-GlcNS、ΔUA2S-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNS6S。