[发明专利]用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基及发酵制备方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程和天然产物的生物合成领域。更具体的，本发明涉及一种发酵制备喷司他丁的方法。

背景技术

喷司他丁（pentostatin），又名喷司他汀、喷妥司汀、脱氧助间型霉素，其化学名为：(8R)-3-(2-脱氧-β-D-赤-戊呋喃糖基)-3,6,7,8-四氢咪唑[4,5-d][1,3]二氮杂卓-8-醇（(8R)-3-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol），化学式为：C₁₁H₁₆N₄O₄，结构式如式（I）。1974年Warner Lambert公司的Peter W.K.Woo等人首次从Streptomyces antiboticus发酵液中分离得到。喷司他丁是一种高效的腺苷脱氨酶（ADA）抑制剂，能够与ADA紧密结合并抑制其活性，进而使肿瘤细胞内大量积累脱氧腺苷三磷酸（dATP）和脱氧腺苷，从而使DNA或RNA的合成受到抑制，最终导致肿瘤细胞死亡。1998年2月美国FDA正式批准了注射用喷司他丁（商品名）上市，主要用于干细胞白血病（Hairy cell leukemia,HCL）、慢性淋巴细胞白血病（ChroniclympH=ocytic leukemia,CLL）、移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）及蕈样霉菌病（Mycosis fungoides）的治疗。

目前，制备喷司他丁主要有化学合成法和生物合成法。由于喷司他丁特殊的七元杂环结构及七元杂环上的手性醇结构，使得喷司他丁的化学合成较为困难。目前文献中报道的化学合成方法路线繁杂，过程中需要提供强酸、强碱、高温、低温环境和使用有毒的有机溶剂，且需对中间产物进行多次提纯，工艺复杂、成本较高，收率较低，故化学合成不是制备喷司他丁的理想途径。生物合成法主要是指液体深层发酵，在适宜的条件下，通过微生物的生长与代谢将廉价原料转化为喷司他丁，整个生产过程条件温和，没有强酸、强碱、有毒试剂的使用，生产成本低于化学合成法，因而成为喷司他丁合成的主流方法。

文献报道最优方法为2011年上海工业医药研究所发明专利（CN102234673A）实施例中提供，该方法利用抗生链霉菌NRRL3238发酵制备喷司他丁，其培养基配方为：葡萄糖40.0g/L，细豆粕30.0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5.0g/L，NaCl5.0g/L，泡敌0.05g/L，温度30℃，pH=6.5，溶氧40%，通气量0.5vvm，24h开始流加葡萄糖1-10‰L/h，发酵周期72h，喷司他丁产量达55mg/L。

目前，制约喷司他丁生物合成产业化的主要因素是发酵工艺不成熟，发酵液中喷司他丁浓度较低。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基。

本发明的第二个目的是提供一种发酵制备喷司他丁的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基，包括下述组份：碳源3～10g，氮源21～60g，(NH₄)₂SO₄0～0.5g，加水至1L。

优选的是：碳源为3～7g，氮源为35～50g，(NH₄)₂SO₄为0～0.3g。

优选的是：碳源为4～5g，氮源为42～45g(NH₄)₂SO₄为0～0.1g。

碳源优选为：葡萄糖、糊精、麦芽糖醇、可溶性淀粉、山梨醇、木糖醇或大米粉。

氮源优选为：酵母浸粉、麦芽浸粉、高温豆粕粉、棉籽粉、脱脂豆粉、麸皮和秘鲁鱼粉至少一种。

一种发酵制备喷司他丁的方法，包括如下步骤：

（1）将链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到摇瓶种子培养基中，在200～350r/min，28～34℃摇床中，培养36～72h，得到种子液；

（2）将种子液按体积接种量为3%～20%的比例接种到发酵培养基中，在150～300r/min，28～34℃摇床中，培养200～400h，收集发酵液；