[发明专利]一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液及培养方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液，以及利用所述牛胚胎体外培养液进行牛胚胎体外培养的方法。

（二）背景技术

随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，利用体外受精技术生产体外胚胎呈现出潜在的广阔应用前景。家畜胚胎体外生产尤其是体细胞核移植是快速扩大优秀种群数量的有效途径。虽然通过体外受精技术已经获得了活的后代，但体外受精后的早期胚胎体外发育率较低，限制了胚胎体外生产在实践中的推广应用。

体内早期胚胎的发育在避光、低氧气浓度（约7%）的雌性生殖道内完成，并且有输卵管和子宫分泌的粘液保护。但胚胎的体外培养在约含20%氧气的培养箱中完成，这种高浓度氧气将对体外培养的胚胎产生显著的氧化应激。并且体外胚胎脱离了母体的保护，不仅会受到氧化应激的损伤，还面临日光或灯光刺激、渗透压变化等因素的影响。这些不利因素直接导致了目前体外胚胎的早期发育率显著低于体内胚胎，已成为体外受精等胚胎体外生产技术推广应用的一个瓶颈。

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖，化学性质稳定，对热、酸都不敏感，并具有独特的生物学特性、对生物抗脱水的保护作用、抗冷冻保护作用和抗高渗保护作用，在各种恶劣环境下，海藻糖表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子良好的保护作用。对于海藻糖的研究已有文献报道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A等多种专利申请公开了海藻糖的合成或纯化方法。CN101181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多种专利公开了海藻糖在医药领域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多种专利公开了海藻糖用作动物饲料添加剂的用途。但到目前为止，尚未见有关海藻糖用于家畜繁殖技术领域，特别是用于胚胎体外培养的报道。

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液及培养方法，本申请发明人就海藻糖用于牛胚胎体外培养进行了长时间的研究，从而完成了本发明，该培养液具有缓解体外环境对早期胚胎的多种应激损伤，提高卵母细胞体外受精后胚胎发育率的功能。

本发明采用的技术方案是：

一种含海藻糖的牛胚胎体外培养液，所述牛胚胎体外培养液组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶剂为SOF培养液。

所述海藻糖已有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产和销售厂家有河南华诺海藻生物工程有限公司、武汉富瑞斯凯材料供应有限公司、厦门美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本发明中所用海藻糖购自Sigma公司，纯度大于98%。

所述大豆甙元已有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产和销售厂家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本发明中所用大豆甙元购自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有机溶剂如DMSO溶解之后再进行培养基的配制。

优选的，所述培养液组成如下：

溶剂为SOF培养液。

本发明还涉及一种利用所述牛胚胎体外培养液进行牛胚胎体外培养的方法，所述方法包括：将受精后的早期牛胚胎用SOF培养液反复冲洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎体外培养液中，于38～39℃、5%CO₂的环境内，进行胚胎体外培养。

所述早期牛胚胎由牛卵母细胞经常规体外成熟培养、体外受精获得。

优选的，所述方法如下：

（1）配制牛卵母细胞体外成熟培养液，组成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，血清体积百分含量8%～20%，溶剂为常规培养液；所述常规培养液为M199、DMEM、F12、MEM中的一种或多种；所述的血清可为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一种；