[发明专利]一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于检测下列病原体的探针：黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗病毒WNV-PF、乙型脑炎病毒的探针JEV-PF、登革I型病毒的探针DV1-PF、登革Ⅱ型病毒的探针DV2-PF、登革Ⅲ型病毒的探针DV3-PF、登革Ⅳ型病毒的探针DV4-PF、间日疟原虫的探针PV-PF、三日疟原虫的探针PM-PF、卵形疟原虫的探针PO-PF和恶性疟原虫的探针PF-PF，上述探针的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：1-12所示。

2.根据权利要求1所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于扩增下列病原体目的片段的PCR引物对：

黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R，其序列参见SEQ ID NO：13-14；

基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R，其序列参见SEQ ID NO：15-16；

西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，其序列参见SEQ ID NO：17-18；

乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R，其序列参见SEQ ID NO：19-20；

登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R，其序列参见SEQ ID NO：21-22；

登革Ⅱ型病毒的引物对DV2-F 和DV2-R，其序列参见SEQ ID NO：23-24；

登革Ⅲ型病毒的引物对DV3-F和DV3-R，其序列参见SEQ ID NO：25-26；

登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R，其序列参见SEQ ID NO：27-28；

疟原虫的通用引物对PU-F2和PU-R2，其序列参见SEQ ID NO：29-30。

3.根据权利要求2所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于每对引物对中有一个5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。

4.根据权利要求2或3所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括反转录引物混合液，其反转录引物序列参见SEQ ID NO：31-38。

5.一种多种蚊媒病原体的检测方法，基于微球的液相芯片技术，其特征在于具体包括以下步骤：

①合成权利要求2所述的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；

②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；

③抽提待测样本的DNA和RNA，并采用多重反转录反应的方法将RNA的特定基因序列反转录成cDNA；

④以cDNA/DNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

⑤将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。

6.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤③中所述反转录采用权利要求3中的反转录引物混合液。

7.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中的PCR扩增采用不对称扩增，每对引物对中下游引物的浓度是上游引物浓度的3~8倍。

8.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中所述PCR扩增采用三个PCR反应体系，分别为PCR反应体系I、PCR反应体系Ⅱ和PCR反应体系Ⅲ；其中PCR反应体系I含有西尼罗病毒引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系Ⅱ含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R、以及登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R；PCR反应体系Ⅲ包括CHIKV-F和CHIKV-R、JEV-F和JEV-R、DV2-F和DV2-R、DV3-F和DV3-R、PU-F和PU-R；

步骤⑤中，首先将PCR反应体系I、PCR反应体系Ⅱ和PCR反应体系Ⅲ中取等体积的扩增产物加入至同一试管内，然后再与微球组温育杂交。

9.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤⑤中温育杂交的条件为：96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。