[发明专利]小纤溶酶突变体及其制备方法和应用

权利要求书

1.小纤溶酶（mPlm）突变体，是由野生型mPlm K⁶⁹⁸位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺所得。

2.根据权利要求1所述的小纤溶酶（mPlm）突变体，其特征在于，所述野生型mPlm的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的小纤溶酶（mPlm）突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1～3任一项所述的小纤溶酶（mPlm）突变体的编码基因。

5.根据权利要求4所述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

6.小纤溶酶突变体的生产方法，包括如下步骤：

1）将mPlm突变体编码基因插入表达载体中；

2）再将表达载体转入宿主菌中，培养携带表达质粒的宿主菌，在内含体中诱导蛋白的表达合成；

3）通过冻融和漂洗来纯化内含体纯化内含体；

4）用内含体溶解缓冲液将内含子溶解；

5）将变性蛋白再折叠成它的天然构象；

6) 分离纯化正确折叠的mPlm突变体蛋白；

7）蛋白活化。

7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤1）的具体操作为：

（1）合成mPlm突变体基因；

（2）用NdeI、BamHI双酶切mPlm突变体基因制备mPlm突变体插入片段；

（3）用T4 DNA连接酶将mPlm突变体插入片段接入pET11载体中，得到mPlm突变体表达载体。

8.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤2）的具体操作为：将mPlm突变体表达载体转化到宿主菌BL21(DE3)中，在高密度的自诱导系统中表达小纤溶酶突变体。

9.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤3）的具体操作为：冻融裂解收集的mPlm突变体表达菌体，超声打碎菌体裂解释放的染色质；离心收集内含体；用洗涤缓冲液漂洗内含体。

10.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤4）所述的内含体溶解缓冲液的组成为：8 M 尿素（urea），0.1 M Tris，1 mM 甘氨酸（glycine），1 mM EDTA，10 mM β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol），10 mM二硫苏糖醇(DTT)，1 mM谷胱甘肽(GSH)，0.1 mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH 10。

11.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤5）是采用PI开发的Pt-Fold“通用”再折叠程序将变性蛋白再折叠成它的天然构象。

12.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤6）所述的亲和层析方法为SEC、IEX或采用苯甲醚-琼脂糖凝胶6B柱（Benzamidine Sepharose 6B column）进行的亲和层析法。

13.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤7）的具体操作为：再折叠纯化后的mPlm突变体经SAK活化成有活性的mPlm。

14.小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。