[发明专利]小纤溶酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小纤溶酶突变体，及其折叠、活化方法，以及该小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。

背景技术

当血块阻碍动脉血液流至身体远处部分，例如腿部、手臂、脚部或手部时，外周动脉闭塞性疾病（Peripheral Arterial Occlusion, PAO）就会发生。PAO一个经典的早期特征就是“间歇性跛行（Intermittent claudication）”或者腿部持续疼痛，但休息后疼痛消失。血液流动持续受抑最终会导致腿部或肢体甚至在休息时也仍然不断疼痛、溃疡、组织坏死、坏疽（gangrene）、并且最终导致截肢。PAO是外周动脉疾病（peripheral arterial disease, PAD）的结果。

纤溶酶原激活剂（plasminogen activator, PA），例如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓疗法不仅可用于治疗急性心肌梗死，还可用于治疗外周动脉闭塞性疾病（Peripheral Arterial Occlusion, PAO）。据了解，颅内出血（intracerebral hemorrhage, ICH）的致命风险是比较高（0.4-2.9%），对于PAO患者来说尤为如此，因为它的治疗时间需耗费一至两天。此外，凝缩的血块太大以及血液流通不畅均会导致可溶解血块的纤溶酶（plasmin, Plm）耗竭，而PA底物由于位于PAO血栓附近，只能发挥部分功效。鉴于此，PA溶栓疗法并未正式获得FDA的认可和批准；但由于目前美国还没有更好的药物，所以近25%的PAO病例的治疗过程都需要PA的参与。最近发表的动物研究指出，导管介入（catheter-administered）纤溶酶或它的des-kringle衍生物可能是PA的更为理想的替代物，因为它在血液中的循环半衰期非常短，不会造成溢血。除此之外，这些PA替代物不会出现由于凝缩的血块太大而造成纤溶酶耗竭的问题。我们已经制备了重组型小纤溶酶（miniPlasmin, mPlm），并证实它适用于治疗动物模型的PAO。但值得注意的是，我们之前的研究曾发现，对活性mPlm的K⁶⁹⁸位点进行非特异性剪切极大减弱了剪切产生的mPlm的比活性，从而阻碍这种有潜力的药物的进一步开发。因此，开发一类保留原有催化特性，但是非特异性剪切程度低的mPlm突变体具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于一个一种小纤溶酶突变体，其保留了小纤溶酶（mPlm）原有的催化特性，但在活化过程中的非特异剪切程度低，比活力高。

本发明的另一个目的是提供一种上述小纤溶酶突变体的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

小纤溶酶（mPlm）突变体，是由野生型mPlm K⁶⁹⁸位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺所得。

所述野生型mPlm的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

上述小纤溶酶（mPlm）突变体的编码基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

小纤溶酶突变体的生产方法，包括如下步骤：

1）将mPlm突变体编码基因插入表达载体中；

2）再将表达载体转入宿主菌中，培养携带表达质粒的宿主菌，在内含体中诱导蛋白的表达合成；

3）通过冻融和漂洗来纯化内含体纯化内含体；

4）用内含体溶解缓冲液将内含子溶解；

5）将变性蛋白再折叠成它的天然构象；

6) 分离纯化正确折叠的mPlm突变体蛋白；

7）蛋白活化。

步骤1）的具体操作为：

（1）合成mPlm突变体基因；

（2）用NdeI、BamHI双酶切mPlm突变体基因制备mPlm突变体插入片段；

（3）用T4 DNA连接酶将mPlm突变体插入片段接入pET11载体中，得到mPlm突变体表达载体。

步骤2）的具体操作为：将mPlm突变体表达载体转化到宿主菌BL21(DE3)中，在高密度的自诱导系统中表达小纤溶酶突变体。

步骤3）的具体操作为：冻融裂解收集的mPlm突变体表达菌体，超声打碎菌体裂解释放的染色质；离心收集内含体；用洗涤缓冲液漂洗内含体。