[发明专利]狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法

权利要求书

1.狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将RV CTN-1V5在vero细胞中连续传10代，得到CTN-1V15株。

步骤二：将CTN-1V15株毒种在鸡胚中传1代，获得的RV CTN鸡胚一代病毒。

步骤三：将RV CTN鸡胚一代病毒在鸡胚成纤维细胞中进行传代，使其逐渐适应鸡胚成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤一中，是用pH7.4的PBS将RV CTN-1V5做10倍系列稀释，然后按照1:100～1:1000的比例接种vero单层细胞，37℃吸附60分钟后补加细胞维持液，置于37℃、5%CO₂培养箱内静置培养，培养4～6天收获病毒上清液，如此连续传10代，得到CTN-1V15株。

3.根据权利要求2所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤二中，是将CTN-1V15株毒种经pH7.4的PBS经1:10～1:1000稀释后，取病毒稀释液经卵黄囊接种6～7日龄的SPF鸡胚，每胚0.5ml，置于37～39℃、相对湿度40～80%的全自动孵蛋箱内进行孵育，孵育至72～144小时，收取濒临死亡但未死亡的胚胎，去除鸡胚的头后，将躯干研磨粉碎，并按照鸡胚重量加入病毒保护液制备成10%的病毒悬液，然后2000rpm、4℃离心10分钟，如此传一代获得CTNCE01。

4.根据权利要求3所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，所述步骤三中，是将CTNCE01用pH7.4的PBS以10⁰～10^-4稀释后，按照接种比例1:10～1:5×10⁵与CEC悬液混合均匀，分装入细胞培养瓶内，置于35～37℃、5%CO₂培养箱内培养，培养至细胞出现病变收获病毒液，继续将病毒在CEC悬液上按照上述培养条件进行传代，适应并稳定后得到CTNCEC25株。

5.根据权利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代中所使用的CEC悬液制备中采用的培养基为以199培养基为基础，补充牛血清、HEPES和人血白蛋白，使牛血清的终含量为3～10%，HEPES终含量为20mmol/L，人血白蛋白的终含量为0.3～3%，并用7.5%的碳酸氢钠溶液将pH调节至7.4～7.8。

6.根据权利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代所使用的温度为33～36℃。

7.根据权利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，步骤三中传代病毒接种的最佳MOI为0.001～0.05FFU/细胞，收获病毒液的最佳时间为接种后72～96小时。

8.根据权利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法，其特征在于，每一代毒种的病毒滴度均采用细胞荧光灶转化单位实验进行。

9.根据权利要求4得到的CTNCEC25株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。