[发明专利]狂犬病病毒CTN-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法

说明书

技术领域

本发明涉及狂犬病疫苗领域，具体涉及将狂犬病病毒CTN-1株适应于原代鸡胚成纤维细胞的方法。

背景技术

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）是高度嗜神经病毒，为弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus genus）中不分节段的单股负链RNA病毒，能引起人兽共患的世界性传染病—狂犬病。据报道全世界每年因狂犬病的死亡人数约有5.5万例,实际死亡人数应明显高于该统计数字（http://www.worldrabiesday.org/）。目前除日本、英国、夏威夷等少数国家和地区没有狂犬病发生以外,该病呈世界性分布。亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区,占全世界死亡总人数的99%。在正式报告狂犬病的国家中,印度每年有3万人以上死于狂犬病,居首位；我国近20年每年统计到的死亡人数超过3000例,居第二位(Yunpeng wang et al.,2012.Journal of Applied Virology.1:10-19)。目前尚无法医治狂犬病，疫苗接种免疫是预防狂犬病的唯一有效途径。

狂犬病疫苗是由灭活或减毒的RV制备。由于RV是嗜神经性病毒，几乎对所有哺乳动物的神经组织都具有侵染性。世界上首次试用的狂犬病疫苗就是用RV感染兔脊髓研制的，以后经兔脑、小鼠脑、羊脑等动物神经组织培养，制备疫苗。但由于该类疫苗效力低且存在严重的变态反应而被WHO停用（林放涛等.1992.狂犬病学.203-221;Meslin F.X.et.al.,1996.Laboratory techniques in rabies.4^th ed.WHO.223-313）。1958年Kissling等将RV街毒株和固定毒株在原代地鼠肾细胞中传代（Kissing P.E.et al.,1958.Proc.Soc Exp Biol Med.98:223-225）。20世纪60年代以后用细胞制备疫苗有了很大发展，人们开始利用各种细胞来大规模生产狂犬病疫苗，特别是人二倍体细胞培养疫苗（HDCV）的研制（Wiktor etal.,1964.J Immunol.93:353-366）。由于不存在神经元组织，与之前的脑组织疫苗相比，组织培养疫苗不仅更安全，而且更有效。目前已批准若干种组织培养疫苗，其具有与HDCV相当的疗效和安全性,例如纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）（Barth et al.,1984.J BiolStand.12:29-64;Schgal et al.,1993.J.Commun.Dis.27:36-43）和纯化vero细胞狂犬病疫苗（PVRV）(Suntharasamal et al.,1986.Lancet.2:129-131)。

RV CTN-1株是WHO和我国有关部门批准用于疫苗生产的毒株，由中国食品药品检定研究院建株和保存。20世纪80年代李宏玲等将RV CTN-1株在vero细胞中培养进行适应传代，得到较高滴度的CTN vero细胞适应株，可用于疫苗生产（李宏玲等.1989.生物制品学杂志.2:22-25）。董关木等进一步证实RV CTN-1株可在vero细胞内快速适应，滴度可到7.0logLD₅₀/ml以上，并可多次收获病毒培养液（董关木等.1995.微生物学免疫学进展.23:82-85）。目前已有多家生产单位应用RV CTN-1株生产vero细胞疫苗并取得生产文号和投产（俞永新.2008.狂犬病和狂犬病疫苗.第二版:192-208）。但vero细胞基质为永生性传代细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留DNA（Ref.欧洲药典.2004.中国药典.2010），因为其可能具有传递潜伏病毒和其他物质的风险。WHO也规定人用制品的残留DNA剂量应不超过10ng（WHO Expert Committee on Biological Standardition.Recommendations inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates andembryonated eggs.Genava.WHO.2005）。