[发明专利]一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，属于微生物生产利用领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）被世界卫生组织归为2A类致癌物质，与丙烯胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾病。氨基甲酸乙酯广泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油等食品。此前中国酱油中的氯丙醇超标而被欧盟禁购的事件引起轩然大波。如今酱油中的氨基甲酸乙酯引起了国际的广泛关注，而国内对酱油中氨基甲酸乙酯的降低方法未见报道。对此我国的酱油行业应该吸取由于某些品种的酱油中氯丙醇超标引起广泛关注而带来的被动局面的教训，及早地开展研究，突破国际市场对我国调味品出口筑起的技术壁垒。

酱油中氨基甲酸乙酯前体物质主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。对中国南方一家酱油厂的日式酱油研究结果表明：发酵终点时原油中乙醇含量为2.5%、瓜氨酸含量为2.2g/L、尿素为57mg/L。通过底物反应实验得知，乙醇和瓜氨酸是酱油中EC的主要前提物质。本研究采用在酱油发酵过程中加入一株嗜盐四联球菌降解瓜氨酸，从而降低酱油中氨基甲酸乙酯的前体物质。嗜盐四联球菌是食品安全菌。在酱油发酵过程中加入它会大大提升酱油风味，缩短生产周期。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，是在酱油酿造过程中添加嗜盐四联球菌，降解酱油酿造过程中氨基甲酸乙酯的主要前体物质——瓜氨酸的含量。

所述嗜盐四联球菌是在成曲拌盐水时接入，使混曲中的嗜盐四联球菌达到10⁶～10⁷CFU/mL。

所述嗜盐四联球菌优选嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）BBE R23，保藏编号为CCTCC NO:M2013480，保藏日期为2013年10月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学。

所述方法的具体步骤为：（1）制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃放气。按比例接入麸皮、面粉，大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8x10⁹个/g，恒温箱中30℃培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h后，曲变成嫩绿色，制曲完成。（2）发酵：成曲与20%（w/v）盐水以体积比为1:1.7的比例混合，并接种嗜盐四联球菌，控温10-15℃，发酵第7天接种10⁷CFU/mL鲁氏酵母，发酵第14天接种10⁷CFU/mL鲁氏酵母，常温发酵，第80天结束发酵。

本发明在酱油制作过程中加入一株嗜盐四联球菌，相比未接种嗜盐四联球菌，酱油中EC的重要前体物质瓜氨酸的含量减少了98%。而且增加了酱油中的游离氨基酸含量，为将来工厂化降低酱油中EC含量同时提高酱油营养价值打下坚实基础。

具体实施方式

EC含量的测定方法：

样品处理：将以1mL超纯水配制的含尿素、乙醇、瓜氨酸的95℃30min热反应后的样品液，用0.22μm滤头过滤。

GC条件：Agilent DB-WAX30m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：230℃，柱室温度：初始温度60℃（5min），以3.5℃/min程序升温至150℃（保持2min），以10℃/min，升到220℃（保持10min）；载气：高纯氦气，柱前压80kPa，流速1mL/min，不分流，进样2uL。

MS条件：接口温度：220℃；电离方式：EI；电子能量：70Ev；电子源温度230℃，四级杆温度150℃；调谐方式：标准调谐；SIM模式；定量离子62；定性离子74,89；外标法定量。

EC标准曲线制作：用超纯水将EC标样配制成40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L。用GC-MS检测，在以EC浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。Y=1662.76x-18902.71,R²=0.997。

酱油中瓜氨酸含量的检测：

样品预处理：取1mL酱油样品，加入25mL容量瓶中。用5%(w/v)的三氯乙酸定容至25mL，放在超声仪上超脱10min后，放置5min（防止过热），再超脱10min。静置30min，玻璃棒混匀后在虑纸上过滤。取1mL样品经过0.22μm虑头过滤后进样检测。