[发明专利]一种检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列

权利要求书

1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列，引物包括：

上游引物pZF：gccaggcaaatatgtttgtga

下游引物pZR：catttggcatttgaacgatgaa；

探针pZP：cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。

2.权利要求1所述引物和探针序列用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的方法，该方法不适用于疾病诊断检测，包括：

1）待检模板的制备：

取粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；

2）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应体系：

组分                        用量/终浓度

Premix EX Taq 2×                12.5μL

引物                           0.4μmol/L

探针                           0.2μmol/L 

Rox II                          0.5μL

模板                            1μL

ddH₂O                         9.5μL

将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应过程为：95℃ 10min，预变性；95℃ 10 s，60℃ 1min，40个循环，实验结果实时监测；

大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，显示阳性扩增曲线，则待检样品中含有大肠杆菌O157:H7；无扩增信号，则待检样品不含有大肠杆菌O157:H7。