[发明专利]一种检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列

说明书

一、技术领域

本发明属于生物和食品检测技术领域。具体涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针序列。

二、背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)O157:H7是常见的肠道致病菌，感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5%～10%。

1982年，Riley等报道了由EHECO157:H7引起的出血性结肠炎的暴发流行，这也是把EHECO157:H7确认为严重致病菌的首次报道。随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行。1999年，在我国安徽、江苏两省曾暴发流行O157:H7感染性腹泻，患者超过2万人，死亡177人，流行时间7个月，可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。我国已将EHEC列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。

目前，目前检测EHECO157:H7的方法主要有常规的细菌分离鉴定、基因芯片技术、噬菌体分型技术、脉冲场凝胶电泳分析技术、生物传感器技术、利用单克隆抗体建立的ELISA、乳胶凝集实验、免疫磁分离技术以及胶体金免疫层析试纸条等，但存在操作复杂费时、仪器要求高、灵敏度或特异性不强等缺点。随着分子生物学技术的发展，PCR也被广泛的用到EHECO157:H7疾病的快速诊断中，此方法简单、方便、快速、敏感，但存在假阳性和PCR污染等弊端。而荧光PCR方法技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一堆特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测核苷酸的技术，除了具有普通PCR的有点外，还具有更多的优点：其特异性更高，灵敏性更高；全封闭反应，无需PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性；可实现单管双检或多检；不接触有毒试剂，操作简单；有利于规模化、自动化。

我们在前期研究中发现，在不同的产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin E.coli,STEC）菌株中，含有一个共有的ORF编码大肠杆菌O157:H7的标签性基因。

基于以上的研究和当前的需求，申请人根据大肠杆菌O157:H7的特异性基因序列，设计了用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针。

三、发现内容

发明内容

技术问题

本发明目的是提供一种专一性检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针。

技术方案

本方法采用以下技术方案：

1、一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物对，所述的引物对为：由序列为gccaggcaaatatgtttgtga的上游引物pZF和序列为catttggcatttgaacgatgaa的下游引物pZR组成的引物对。

2、一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的探针，所述的探针pZP序列为cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。

上述引物和探针序列用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的方法，该方法不适于疾病诊断检测，包括：

1）待检模板的制备：

粪便或者食物样品10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中;如待检样品为液体，则直接取1mL液体样品加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；

2）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应体系：

将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应过程为：95℃10min，预变性；95℃10s，60℃1min，40个循环，实验结果实时监测。

3）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有大肠杆菌O157:H7，则显示阳性扩增曲线；若待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7，则无扩增信号。

4）敏感性试验：选用模拟制备的大肠杆菌O157:H7污染样品分析引物和探针的敏感性。

有益效果