[发明专利]肿瘤坏死因子-α转化酶的多肽抑制剂的筛选方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质类药物的相关设计，具体涉及TNF-α转化酶的多肽抑制剂的筛选，以此构建以TNF-α转化酶为靶标的多肽药物。

背景技术

蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在各种蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程都由蛋白酶进行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其调控机制出现问题，造成蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相应的各类疾病。因此，通过药物来调控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结构为基础的药物设计，是设计以蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。

人体中，有4%左右的蛋白质首先是表达为膜蛋白，然后在相关蛋白酶的作用下，膜外部分被剪切下来，释放到胞外环境中，发挥相应的生物学功能。这种生物学过程称为膜外结构域脱落（Ectodomain Shedding），相应的蛋白酶也称为脱落酶（Sheddase）。肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE，TNF-α转化酶）是目前研究最为深入的脱落酶之一。目前已经发现，人体中有至少七十多种蛋白质的膜外结构域脱落有肿瘤坏死因子-α转化酶的参与。这些蛋白质包括很多非常重要的疾病相关蛋白因子，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），肿瘤坏死因子受体I和受体II，转化生长因子-α（TGF-α），白介素-6受体-α（IL-6Rα）等，因此肿瘤坏死因子-α转化酶也成为一个重要的药物靶标。例如，可溶性的高活性TNF-α在类风湿性关节炎组织中具有明显高于正常组织的表达水平，通过抑制可溶性TNF-α的生物学活性，已经证明能够有效治疗和缓解类风湿性关节炎的病症，上市的药物包括依那昔普（Enbrel）、英利昔单抗（Remicade）和阿达木单抗（ＨumiRA）等。而如果抑制肿瘤坏死因子-α转化酶的生物学活性，那么可溶性的高活性TNF-α的量也会随之减少，因此同样也能够达到治疗的目的。近些年来，国际上很多公司针对肿瘤坏死因子-α转化酶开发了很多抑制剂，有些已经进入二期甚至三期临床。目前对肿瘤坏死因子-α转化酶抑制剂的研究，存在的一个主要问题是，人们不了解它的目标底物结合方式，目前还没有关于该催化结构域与其多肽底物的复合物结构的任何报道，因此也不了解其底物特异性与活性的机理。如果能够有一个合理的复合物结构模型，采用基于结构的药物设计方法，将有可能设计出更好的具有高特异性的肿瘤坏死因子-α转化酶抑制剂。

发明内容

本发明涉及肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE）的多肽抑制剂的筛选方法及其应用；所述方法先建立合理的TACE与多肽底物的复合物模型，用以指导多肽抑制剂的设计，然后通过检测一系列指标，如结合能力、抑制能力等，筛选出可作为多肽抑制剂的候选多肽；所选出的多肽特异性高，活性强，可进一步用于设计以肿瘤坏死因子-α转化酶为靶标的多肽药物。

上述筛选方法包括如下步骤：（1）检测候选多肽与TACE的结合能力，选择能结合的多肽；（2）检测选择出的多肽能否被TACE剪切，选择能被剪切的多肽；（3）检测选择出的多肽抑制TACE细胞活性的能力，选择有抑制效果的多肽。其中优选的，所述候选多肽选自TACE的底物多肽，如通过计算机辅助蛋白质设计的方法获得的具有较高亲和力的多肽作为候选多肽、或者现有技术中已公开的具有亲和力的多肽作为候选多肽。其中优选的，步骤（1）～（3）中，所述选择是相对于阴性对照进行的。

BLItz单样本分子相互作用分析仪是利用生物膜层干涉技术对生物分子相互作用进行定量检测的仪器，其基本原理是，首先将一个分子固定到探头上，当另一个分子与固定的分子相互作用时，会引起光的干涉效应的改变，从而可以被光探测器检测到。在我们的实验中，TACE通过生物素化后，固定在生物素亲和探头上，以此固定TACE，用来检测多肽与TACE的结合。为增大检测信号，多肽合成后与牛血清蛋白BSA进行交联。由此优选的，步骤（1）是为了检测多肽与TACE的结合能力，其中将TACE进行生物素化，加入BSA偶联的多肽，用BLItz蛋白相互作用仪进行所述检测；检测完毕后分析数据。步骤（1）对于所有的候选多肽相同。