[发明专利]基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析技术领域，特别涉及小分子腺苷的化学发光检测方法。

背景技术

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，自Drury和Szen-Gyorgyi于1929年证实心肌细胞中存在腺苷之后，许多医学研究证实腺苷不但是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，而且可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。另外，大量研究表明在尿中腺苷含量可作为肿瘤的潜在生物标志物，在癌症诊断、手术疗效评价中具有临床实用价值，因此对腺苷的高灵敏分析检测在许多领域具有重要的意义。

金纳米((Au nanoparticles, AuNPs) 毒性小、粒径小，易于被细胞摄取，经功能化修饰后，可以用于生物成像、药物与基因传递等治疗与诊断领域。另外，AuNPs具有卓越的电传导性、等离子体共振特性、高催化性和高稳定性，且其表面易于修饰，已在光学、电化学等生物传感器构建方面大受欢迎。故AuNPs以其优良的电学、光学、热力学等性能，已广泛地应用于物理学、化学、生物学、医学和材料科学及其交叉学科。化学发光(chemiluminescence，CL)分析法是根据化学反应产生的可见光的强度来确定物质含量的分析方法。CL分析技术具有分析速度快、灵敏度高、仪器设备简单、线性范围广且适用于微量分析等特性，已广泛应用于分析化学的各个领域。功能化AuNPs一方面可用作CL底物的载体；另一方面，由于AuNPs尺寸小、可控组装、表面效应明显，在NH₂OH/Au³⁺溶液中可在较小粒径的AuNPs表面沉积形成更大颗粒的胶体金，达到放大CL信号的目的。

以AuNPs为核，氯金酸和弱还原剂盐酸羟胺反应生成的金原子沉积在金纳米粒表面，获得更大的分散性较好的金纳米颗粒，从而实现羟胺放大化学发光检测腺苷。

研究者们在单链DNA或RNA自身形成的空间结构与目标分子高效特异结合的基础上，建立随机寡核苷酸文库，将该库中的核苷酸序列与目标分子混合，用洗脱、过滤、亲和色谱、磁性微球等方法筛选出与其特异性结合的核苷酸片段，再通过PCR进行扩增，经多个循环分离得到亲和力和特异性都最高的寡核苷酸结合序列，此技术称为指数富集配体系统进化 (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment， SELEX)技术筛选出的寡核苷酸片段被称为核酸适配体，也称为适体。目前己经通过SELEX技术，筛选到对腺苷具有专一性识别能力的适体，为腺苷的检测提供了一种新的分析平台。本发明将适体技术应用到AuNPs的光学传感器的构建上来，可以兼具二者的优势，显著提高检测的灵敏度与特异性。

发明内容

本发明的目的针对现有检测方法大多数存在仪器设备昂贵、操作费时且需要复杂的样本前处理等的不足，提供一种操作简单基于适体技术的以金纳米为标记物的化学发光检测腺苷的方法。

本发明的操作方案是通过以下步骤实现的：

一种基于适体技术的金纳米及羟胺放大化学发光检测腺苷的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）链霉亲和素金纳米制备：取100mL 0.01%HAuCl₄ 120℃加热至沸腾，迅速加入4mL2%Na₃C₆H₅O₇再沸10min后自然冷却，（为达到更好的效果，用0.1mol/LK₂CO₃调pH至6.8～7.0），再加入10 mL0.022mol/L链霉亲和素，反应10min，加入500μL1%BSA稳定剂，6000r/min离心1h，弃去上清液，沉淀再用1%BSA洗涤三次，最后用pH7.0的0.1mol/L PBS缓冲液定容为100mL，置4℃下保存备用；