[发明专利]一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用

权利要求书

1.一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，所述方法将乳腺管腔细胞与乳腺干细胞进行3D共培养，并在培养过程中加入雌性激素和/或孕激素。

2.如权利要求1所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法具体如下：

1）细胞3D培养：将分离得到的乳腺管腔细胞和乳腺干细胞按照2.5～3.5:1的比例混合，离心得细胞沉淀并加入基质胶，将含有细胞的基质胶铺入培养板，待胶体形成后加入细胞培养液，并在细胞培养液中加入雌激素和孕激素后进行3D培养；

2）培养过程中每天更换新鲜培养液，培养5至7天进行传代。

3.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述传代的具体方法为：去除细胞培养液后加入Dispase酶处理，再加入胰酶处理，然后重悬并离心沉淀，在细胞沉淀中加入基质胶并铺入培养板中培养，传代完成。

4.如权利要求3所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，加入Dispase酶处理时，同时进行吹吸使基质胶完全化掉，Dispase酶处理时间为25-35分钟。

5.如权利要求3所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，胰酶处理时间为5～10分钟。

6.如权利要求3所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，重悬的方法为加入含有5%FBS的PBS重悬。

7.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的比例为3:1。

8.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，培养板为24孔板，培养板每孔中基质胶铺入量与细胞培养液加入量之比为1：10-12。

9.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，雌激素在细胞培养液中的浓度为1-2μM，孕激素在细胞培养液中的浓度为2.5-5μM。

10.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述细胞培养液中不含有FBS胎牛血清。

11.如权利要求10所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，细胞培养液的组分如下：DMEM/F12=1:1,1%PS,1%ITS,50ng/mL EGF。

12.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，3D培养在常规细胞培养箱中进行，保持潮湿并通入5%CO₂，培养温度为37℃。

13.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述乳腺管腔细胞和乳腺干细胞分离步骤如下：

A）乳腺单细胞的制备：将乳腺组织消化、裂解后，再用胰酶处理制备成单细胞，胰酶中加入脱氧核糖核酸酶1去除DNA；

B）流式细胞分选：通过流式细胞技术分离小鼠乳腺管腔细胞和小鼠的乳腺干细胞。

14.如权利要求13所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，将乳腺组织消化的具体方法为：将乳腺组织放入含有胶原酶的消化液消化。

15.如权利要求13所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述裂解的具体方法为：使用红细胞裂解液裂解。

16.如权利要求13所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述步骤（A）中，消化液具体为RPMI-1640，0.025M HEPES，5%FBS，1%PS。

17.如权利要求2所述的体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，其特征在于，所述乳腺管腔细胞为小鼠乳腺管腔细胞，所述乳腺干细胞为与小鼠乳腺干细胞。

18.雌性激素和孕激素在体外扩增乳腺干细胞和/或保持乳腺干细胞特性中的用途。