[发明专利]一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用。

背景技术

干细胞是一类处于未分化状态、但持有多向分化潜能和自我更新能力的原始细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞两大类。成体干细胞存在于多种已分化的组织和器官内，能自我更新并增殖、分化成特定组织的功能细胞。离体后的成体干细胞由于缺失了体内特定微环境信号的调控，会丧失自我更新和多向分化的潜能，迅速走向分化。一直以来，制约成体干细胞研究的一个重要瓶颈就是缺乏非常有效的对各种组织特异性干细胞进行体外培养和扩增的方法，其体外扩增和在体外扩增过程中维持其干细胞的特性是非常困难的。目前唯一涉及临床使用的例子是从烧伤病人的活组织中提取表皮细胞进行培养，但这并不是真正意义上的干细胞培养，因为经过体外培养的这种表皮细胞只能分化成角质细胞。因此成体干细胞体外培养和扩增的技术体系的成功建立将会极大推动着成体干细胞的研究和应用。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已成为威胁妇女健康的主要病因。研究证明，激素影响着乳腺的正常发育和乳腺癌的形成，妇女患乳腺癌的风险和其生殖的历史及激素的分泌都有重要的关联。然而系统性的激素如何通过局部的信号分子控制乳腺干细胞的自我更新、增殖和影响乳腺癌的发生仍然并不清楚。

现有技术中成体干细胞的体外培养非常困难，尤其突出的是在体外培养时干细胞趋于分化、难以维持其干细胞的特性。以往的研究工作已经证实Wnt信号通路控制着乳腺成体干细胞在体内的自我更新。在此基础上，将纯化的Wnt3A蛋白和3D培养方法结合起来，成功在体外对乳腺干细胞进行了培养和扩增并保持了其干细胞的特性。但是使用这种方法，需要纯化的Wnt3A蛋白，而纯化具有物学活性的Wnt3A蛋白代价昂贵，因此这种培养方法很难普及到大规模的干细胞体外培养以及后续的药物筛选中。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用，用于解决现有技术中的问题。

本发明第一方面提供一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，所述方法将乳腺管腔细胞与乳腺干细胞进行3D共培养，并在培养过程中加入雌性激素（E2）和/或孕激素（Pg）。

较佳的，所述体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法具体如下：

1）细胞3D培养：将分离得到的乳腺管腔细胞和乳腺干细胞按照2.5～3.5:1的比例混合，离心得细胞沉淀并加入基质胶，将含有细胞的基质胶铺入培养板，待胶体形成后加入细胞培养液，并在细胞培养液中加入雌激素和孕激素后进行3D培养；

2）培养过程中每天更换新鲜培养液，培养5至7天进行传代；

优选的，所述传代的具体方法为：去除细胞培养液后加入Dispase酶处理，再加入胰酶处理，然后重悬并离心沉淀，在细胞沉淀中加入基质胶并铺入培养板中培养，传代完成。

更优选的，加入Dispase酶处理时，同时进行吹吸使基质胶完全化掉，Dispase酶处理时间为25-35分钟。

更优选的，胰酶处理时间为5～10分钟。

更优选的，重悬方法为加入含有5%FBS的PBS重悬。

优选的，所述步骤（1）中，乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的比例为3:1。

所述乳腺管腔细胞和乳腺干细胞的比例为细胞数比例。

优选的，所述步骤（1）中，培养板为孔板，培养板每孔中基质胶铺入量与细胞培养液加入量之比为1：10-12。

具体的，培养板可为24孔培养板，培养板每孔中基质胶铺入量为50μL，细胞培养液加入量为500μL。

优选的，所述步骤（1）中，雌激素在细胞培养液中的浓度为1-2μM，孕激素在细胞培养液中的浓度为2.5-5μM。

优选的，所述步骤（1）中，3D培养在常规细胞培养箱中进行，保持潮湿并通入5%CO₂，培养温度为37℃。

所述基质胶为市售的商业化产品，购自BD公司，其使用方法参考商家建议。

所述细胞培养液可为本领域各种常用的细胞培养液。

优选的，所述细胞培养液中不能含有FBS胎牛血清。

更优体的，所述细胞培养液的组分如下：基本培养液：DMEM/F12=1:1,1%PS,1%ITS(商品化产品,从GIBCO-Invitrogen购买),50ng/mL EGF（商品化产品，从BD公司购买）。

优选的，所述乳腺管腔细胞和乳腺干细胞分离步骤如下：